甘肃牛场口蹄疫A 型-O 型-亚I 三价苗免疫抗体阳性率检测与分析

马强 罗莉宁 肖蕾 曹振卿 马振华 马兵奇

（1.甘肃省家畜繁育改良管理站，甘肃兰州 733000；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046；3.兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃兰州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性接触性传染病[1]。全世界均有分布，宿主范围广，主要以偶蹄动物的口、鼻、蹄及乳头等部位发生水疱、溃疡、烂斑等为特征。该病毒血清型较多，危害巨大，可快速传播，致病性和感染性极强，感染发病率可达100%，可导致病畜生产能力下降，对养殖业造成巨大损失。威胁国内的主要是O 型、A型、亚洲I 型，为法定上报的一类动物疾病[2-5]。口蹄疫防控主要依靠注射疫苗，刺激畜体产生抗体，从而抵抗口蹄疫病毒的侵袭。但实际免疫中，很多疫苗无法起到保护作用，尤其是免疫后期家畜更容易发病，病毒传染性也更强，给养殖户造成巨大损失。市面上二价、三价口蹄疫疫苗层出不群，免疫保护期各不相同。其中三价苗相传具有副作用小、免疫保护期长等优点，但由于三价苗抗原纯化工艺复杂，免疫程序制定不合理，多次免疫纯化的灭活疫苗会对机体免疫应答造成一定的干扰，养殖户对三价苗免疫效果评价褒贬不一。本试验选择市面销量较广的金宇保灵生物药品有限公司三价灭活疫苗对各个发育阶段的牛免疫注射，定期检测免疫抗体水平，通过免疫抗体阳性率评判三价苗免疫效果与免疫保护期，改进免疫程序，不仅具有重大临床价值，而且能为制定牛口蹄疫疫苗相关免疫技术标准提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 牛群检测样本

2020—2022 年实验组抽取30 个甘肃地区万头以上牛场进行疫苗注射接种（A 型-O 型-亚I 口蹄疫O型、亚洲I 型、A 型三价灭活疫苗购自金宇保灵生物药品有限公司），注射时间在疫苗有效期内。在每个场随机选取6 月龄内犊牛30 头（公母各15 头），育成公牛30 头、空怀母牛30 头、头胎妊娠母牛30 头、哺乳母牛（指二胎及二胎以上带犊母牛）30 头。

1.1.2 试剂盒

购自兰州中农威特生物科技股份有限公司，改进型口蹄疫A 型、O 型、亚I 抗体体液相阻断检测试剂盒（LB-ELISA）各50 盒。

1.1.3 试验仪器

96 孔ELISA 板、U 型96 孔抗原抗体反应板、封板膜、移液枪、洗板机、恒温箱、离心机、酶标仪等均由甘肃省佳源畜牧生物有限公司实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 接种疫苗并提取血清

所有牛注射疫苗前采血检测抗体效价，同一时间注射疫苗，注射后分别在第1、2、4、6 月采血分离血清（4500r/min 离心5min），并送至实验室检测抗体。

1.2.2 样品的准备

样品血清稀释20 倍后加样，每次取样后更换枪头，准确记录板上每孔样品的位置，样品混合均匀后添加到包被板上。

1.2.3 检测步骤

（1）排板：取出包被板，每块板可检测样品92份，设阳性对照4 孔、阴性对照2 孔。

（2）加样：样品孔每孔加入50μL 稀释后的样品，阴阳对照孔每孔加入50μL 阴阳对照，再向以上各孔中加入50μL 酶结合物，振荡混匀；37℃条件下温育30min。

（3）洗涤：撕去封板膜，将包被板子置于洗板机上，设置洗板程序洗涤5 次。洗涤完毕后取下包被板，拍干残留水分。

（6）显色：两种显色液等比混匀后各孔加100μL，放入37℃恒温箱避光温育15min。

（7）终止：各孔加50μL 终止液停止反应。

（8）读数：酶标仪450nm 读取OD 值。

（9）判定：病毒抗原OD 值＞1，且抗体效价1024±1，阴性效价＜1∶8 判定试验有效；取阳性对照孔中间两孔OD 值除以4 为临界值，样品孔OD 值与临界值对比数值大小，找出临界值在每列样品孔OD值中具体位置，从而判定抗体所对应效价，若效价＞128∶1 为抗体阳性，＜128∶1 为抗体阴性。

1.2.4 数据分析

OD 值用SPSS 行t 检验进行分析。

2 结果

2.1 注射疫苗前各牛场口蹄疫抗体阳性率

受条件限制，相同发育阶段的牛来自不同牛场。此次共检测血清22500 份，由表1 可知，整体亚1 型抗体阳性率（80.79±0.54）%、A 型抗体阳性率（79.86±0.05）%、O 型抗体（78.47±0.32）%，抗体阳性率较高；犊牛抗体阳性率明显低于其他阶段的牛，可能由于犊牛免疫工作不及时造成。

表1 注射疫苗前各牛场口蹄疫免疫抗体阳性率

2.2 不同生长期各场区免疫抗体阳性率

由表2 可知，注射疫苗后育成公牛、空怀母牛、头胎妊娠母牛3 种抗体变化规律相似，头胎妊娠母牛抗体峰值略低于育成公牛与空怀母牛；A 型抗体在免疫后第2 个月抗体阳性率达到峰值，亚1 型、O 型在第4 个月抗体阳性率达到峰值，第6 个月时A 型抗体检出率低于亚1 型、O 型，说明A 型抗体免疫应答快，抗体浓度衰减也快。各阶段牛在注射疫苗1 个月后逐渐产生抗体，6 个月后抗体阳性检出率相比注射前水平更低，可见该疫苗免疫保护期不足6 个月。

表2 不同生长期内各场区免疫抗体阳性率

注射疫苗前犊牛抗体阳性率明显低于其他各阶段牛，说明犊牛免疫能力弱，在注射疫苗前主要靠乳汁中的母源抗体，且大多犊牛为首次免疫，注射疫苗后抗体阳性率峰值为60%上下浮动，明显低于其他发育阶段牛；而哺乳母牛抗体阳性率峰值未达100%，且免疫后1～6 月内抗体水平低于育成公牛、空怀母牛、头胎妊娠母牛，说明哺乳会影响免疫应答中口蹄疫抗体产生；注射口蹄疫三价苗后同一发展阶段牛A 型抗体阳性检出率高于亚Ⅰ型、O 型，说明注射三价苗时口蹄疫A 型抗原最容易刺激牛免疫反应，从而产生抗体。

3 结论

牛注射口蹄疫A 型-O 型-亚I 三价苗1 个月后逐渐产生抗体，A 型抗体阳性率在第2 个月达到峰值，亚1 型、O 型在第4 个月抗体水平达到峰值，注射疫苗后犊牛抗体阳性率明显低于其他发育阶段牛，哺乳导致母牛抗体水平偏低但在保护范围之内，注射口蹄疫三价苗后A 型抗原最容易刺激牛免疫反应，从而产生抗体。

注射金宇保灵生物药品有限公司牛口蹄疫三价苗牛免疫抗体阳性率较高，该疫苗对牛群的保护力较好，口蹄疫抗体阳性检出率为亚1 型（80.79±0.54）%、A 型（79.86±0.05）%、O 型（78.47±0.32）%，免疫水平较高。但犊牛抗体阳性率明显低于其他阶段的牛，需加强犊牛免疫措施、改进犊牛免疫程序，疫苗接种间隔建议不超过6 个月。