西南典型菜地土壤重金属健康风险和毒性效应

田 稳,宗大鹏,方成刚,王成尘,王健敏,向 萍* (.西南林业大学生态与环境学院,环境污染与食品安全及人体健康云南省创新团队,云南 昆明 6504；.通海县农村环境保护能源工作站,云南 通海 6599；.云南省农村科技服务中心,云南 昆明 6500)

2014年全国土壤污染状况调查[1]结果显示,我国土壤重金属镉(Cd)、砷(As)、铅(Pb)、铬(Cr)、铜(Cu)、锌(Zn)、镍(Ni)的点位超标率分别为7.0%、2.7%、1.5%、1.1%、2.1%、0.9%和4.8%.蔬菜是人类饮食的重要组成部分,种植区土壤重金属污染与蔬菜安全和人体健康密切相关[2].土壤中的重金属可以通过直接(经口摄入、皮肤接触、呼吸)或间接(食物链)途径威胁人体健康,越来越多的学者从环境安全与人体健康的角度对其进行研究[3-4].

目前,美国环保署(USEPA)建立的非致癌和致癌风险评估模型被广泛应用于土壤重金属的健康风险评价[5].如 Zeng等[6]研究表明我国农田土壤污染对成人的非致癌危险不明显,但对儿童有轻微的非致癌危险;另一研究发现农业种植区土壤对儿童的非致癌风险与致癌风险均较明显[7].然而,前人的研究绝大部分都是基于重金属总量进行健康风险评价,重金属进入人体后并非完全被吸收[8-10].因此,基于总量的评价方法可能高估了其健康风险.近年来,基于生物可给性的评价方法受到了广泛关注[11].然而生物可给性研究中缺少生物组分,健康风险与健康危害间的关系仍然有待深入研究.细胞毒性实验被广泛应用于重金属对人体的健康危害研究,本文前期利用肠道细胞验证了矿区场地土壤健康风险的评估结果,证实建立基于生物可给性和毒性效应的土壤健康风险精细化评估方法将更为准确[12].研究表明,精细化评估后可以在一定程度上克服现有技术导则计算土壤污染物修复目标值过于严格的问题[13-14].蔬菜种植区土壤重金属污染特征与场地土壤差别巨大,健康风险的精细化评估以及生物可给态重金属对人体胃肠道细胞的毒性效应仍然鲜有报道.

本研究以我国西南典型蔬菜种植区土壤为研究对象,分析土壤重金属的污染特征和生物可给性;比较基于土壤重金属总量和生物可给性的人体健康风险评价结果;借助人体胃黏膜细胞 GES-1研究生物可给态重金属对人体的健康危害,验证其健康风险的准确性,旨在为土壤重金属健康风险的精细化评估提供参考.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于云南省玉溪市通海县(102°30′E～102°52′E,23°55′N～24°14′N)境内(图1).作为云南省20个“一县一业”示范县之一,该县聚焦蔬菜优势特色产业发展,享有国内蔬菜之乡的美誉.研究区属中亚热带半湿润高原凉冬季风气候,年平均气温16.2℃,年平均降雨量 903.7mm,海拔 1350～2443m,全年日照时数 2234.9h,无霜期 272d.土壤类型以赤红壤和红壤为主,2021年全县蔬菜种植面积233.3hm2,产量达153万t,产值达25.5亿元.

图1 研究区土壤采样点分布示意Fig.1 Sampling locations of soils from Tonghai, southwest of China

1.2 样品的采集与处理

土壤样品采集于2021年9～10月.根据研究区蔬菜种植的实际状况,共采集了151份种植白菜(21份)、甘蓝(22份)、芹菜(27份)、蒜苗(24份)、莴笋(20份)、香菜(11份)和玉米(25份)的表层(0～20cm)土壤样品.所有土壤样品均采用“S”型取样,四分法取混合土样约 1.5kg于自封袋,在采样当天运送到实验室,去除动植物残体、石砾、地膜等杂质后自然风干,研磨,分别过10目、60目和100目尼龙筛备用.

1.3 土壤pH值及重金属含量的测定

土壤pH值采用电位法(HJ 962-2018),使用pH计测定,水土比为2.5:1.土壤重金属 Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn和Ni的总含量参照Li等[15]的方法使用X荧光重金属分析仪(XRF, E-max 500)测定.为保证测定质量,分析过程中每个土壤样品均设置 3个平行,同时以土壤成分分析标准物质 GBW07405(GSS-5)进行质量控制,标准物质测定的回收率在±10%之内.

1.4 基于土壤重金属总量的人体健康风险评价

采用美国环境保护署(USEPA)推荐的人体健康风险模型来评价土壤Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn、Ni的致癌风险和Cr、As、Cd、Pb、Ni的非致癌风险.研究表明,经口摄入是土壤重金属直接暴露对人体健康风险贡献最大的途径,因此本研究中仅讨论经口摄入途径的致癌和非致癌风险[16].采用公式(1)计算人群经口摄入重金属平均每日摄入量;重金属对人体的致癌和非致癌风险指数计算如式(2)～(3).

式中:ADI/ADIi为平均每日摄入量,mg/(kg·d);CR 为综合致癌健康风险指数;HI为综合非致癌健康风险指数.公式(1)～(3)中所用参数的含义及取值见表1.

表1 健康风险评价计算参数[4,17-18]Table 1 Parameters used in the calculation of the health risk index

当 CR＜10-6,致癌风险不明显;当 10-6＜CR＜10-4时,可能存在一定的致癌风险;当 CR＞10-4时,存在明显的致癌风险.HI为人体日摄取总量和参考值的比值,当HI＞1时,认为存在非致癌健康风险;当 HI＜1 时,非致癌健康风险不明显[17].

1.5 生物可给性的测定

基于《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)[19],结合健康风险

评价结果,筛选可能存在健康风险的土壤样品共19份(S1～S19),使用体外胃肠模拟(SBRC)法测定胃阶段生物可给性[11].称取0.25g过60目尼龙筛的土壤样品于50mL离心管中,加入模拟胃液至25mL,调节溶液pH值为1.5,置于振荡器中以150r/min的速度在37℃下震荡1h,期间保持pH值不变,震荡结束后以4000r/min的速度离心10min,收集上清液即得到胃相模拟液(以下简称胃液).所得胃液通过0.45μm 滤膜后,一部分用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定重金属含量;另一部分用于细胞毒性实验.每个样品重复测定 3次,并设置胃液空白对照.

土壤中重金属的生物可给性由公式(4)计算[20]:

式中:BA为土壤重金属的生物可给性;Ci为胃液中重金属的含量,mg/L;Vi为胃液的体积,L;Cs为土壤中重金属含量,mg/kg;Ms为土壤称样质量,kg.

1.6 基于生物可给态重金属的人体健康风险评价

生物可给态重金属的人体健康风险由公式(2)、(3)、(5)[9]计算得出:

式中:BA为重金属的生物可给性.

1.7 细胞培养、暴露与及活力测定

人胃黏膜细胞GES-1来自美国模式培养物寄存库(ATCC),将GES-1接种在含完全培养基(DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%青酶素-链霉素)的培养瓶中,在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养.当细胞增殖至 80%时用胰蛋白酶消化传代[20].1.5中的胃液过0.22μm灭菌滤膜后,与DMEM基础培养基以1:10的比例配制细胞暴露液.将GES-1细胞以10000个/孔/100μL的密度接种于 96孔板中,待细胞生长 24h后,吸弃孔内的培养基,向每孔加入 100μL细胞暴露液继续培养,24h后用倒置显微镜(尼康 TS-100)观察细胞形态并拍照.随后,使用 CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定细胞活力的变化,从而分析生物可给态重金属对GES-1细胞的毒性[21].

1.8 数据处理

本研究所有数据均采用平均值和标准差进行汇总,使用 Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8.0等软件对数据进行整理、分析.

2 结果与讨论

2.1 土壤重金属污染特征

如表2所示,研究区土壤 pH值平均值为7.56(5.54～8.43),其中92%的土壤pH＞7,总体呈碱性,极个别土壤呈弱酸性,沐婵等[22]研究也表明土壤总体呈碱性(pH=7.57).此外,pH 值变异系数为6.05%,产生这一变异的原因可能是不同的土地利用和田间管理方式,以及灌溉水质盐碱含量和施肥品种的差异[4].从表2 中可以看出,土壤中 Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn和Ni的平均含量分别为108.04, 13.14, 1.17,32.64, 45.04, 146.08 和 37.30mg/kg,其中,Cr、Cd 和Zn的平均含量超出了云南省土壤背景值[23-24],说明这3种重金属在研究区部分土壤中已经存在一定程度的积累,而As、Pb、Cu、Ni平均含量则未超出云南省背景值,这与Bai等[25]研究结果一致.

表2 研究区土壤pH值及重金属含量统计特征(n=151)Table 2 Statistics of pH value and the heavy metals’ concentration in soils from study area

与《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)[19]中的风险筛选值 (以下简称筛选值)相比,除 Cd的平均含量超过了筛选值外,其他 6种重金属的平均值均低于筛选值,说明除 Cd外,研究区土壤 Cr、As、Pb、Cu、Zn和 Ni总体处于清洁水平,董达诚等[26]对云南陆良县菜地土壤重金属的研究也得到了类似的结果.以筛选值为评价标准,在所有的土壤样品中,Cd的超标率最高,为87.88%;Cr、As、Cu和 Zn的超标率分别为13.80%、1.14%、2.61%和3.07%;Pb和Ni的含量未超出标准.7种重金属的变异系数 Cd(72.73%)＞Cr(61.60%)＞Cu(50.33%)＞Ni(47.78%)＞Zn(37.23%)＞Pb(37.13%)＞As(32.35%),Cd变异系数最大,说明研究区土壤 Cd污染受人类活动影响较大.研究表明,Cd是农业来源的标记金属,因为其积累主要来源于化肥和农药施用[27].此外,Cd也是南方蔬菜地土壤重金属污染最严重的元素[28].地质背景、高强度种植、化肥的施用、地膜覆盖可能是研究区土壤 Cd污染的主要原因[29-30].

2.2 土壤重金属的生物可给性

如图2所示,各重金属的生物可给性顺序为:Cd(35.31% ± 23.21%) ＞ As(29.44% ± 12.25%) ＞ Zn(8.11% ± 5.46%) ＞ Pb(3.11% ± 1.40%) ＞ Cu(2.20% ±1.25%) ＞ Ni(1.56% ± 0.69%) ＞ Cr(0.71% ± 0.40%).不同重金属的生物可给性差异较大,平均生物可给性最高的Cd (35.31%)是最低的Cr (0.71%)的约50倍,这一结果与林承齐等[9]研究结果相似.此外,对于As(14.12%～53.73%)和Cd(5.87%～85.89%),不同土壤样品的生物可给性差异也很大,其中,土壤S1和S15中Cd的生物可给性高达69.87%和85.89%,而土壤S18中Cd的生物可给性仅有5.87%.这一结果说明重金属进入人体后能被吸收的比例不同,这可能与土壤类型、重金属的种类、重金属的赋存形态、土壤理化性质(如土壤pH值、有机碳含量、粘土矿物和金属氧化物含量)等有关[31].

图2 土壤重金属的生物可给性Fig.2 The bioaccessibility of heavy metals in soils

2.3 基于土壤重金属总量的健康风险评价

如图3所示,只考虑单一元素时,Cr、As和 Ni的致癌风险指数分别 2.96×10-5、3.47×10-5和 1.08×10-5,介于10-4～10-6之间;Cd和Pb的致癌风险指数小于10-6,说明Cr、As和Ni可能存在致癌风险,而Cd和Pb的致癌风险不明显.考虑多元素的致癌风险时,重金属的综合致癌风险指数(CR)为7.92×10-5,说明研究区土壤很可能存在由重金属引起的综合致癌风险,与林承奇等[9]研究结果一致.此外,Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的非致癌风险和综合非致癌风险(HI)均远小于1,说明7种重金属的非致癌风险和综合非致癌风险均不明显,Varol等[16]研究也表明通过摄入途径在研究区暴露于土壤重金属的成人和儿童不存在非致癌健康风险.研究区土壤样品重金属的综合致癌风险指数和综合非致癌风险指数分布情况见图4.所有土壤样品的综合非致癌风险指数均小于1;但值得注意的是,有 25.83%的研究区土壤样品的综合致癌风险指数大于 10-4,说明这些土壤样品的致癌风险明显,其健康风险不可忽视.

图3 研究区土壤重金属的健康风险评价Fig.3 Health risk assessment of heavy metals in soils from study areas

图4 研究区土壤重金属综合致癌和非致癌风险指数分布Fig.4 Distribution of comprehensive carcinogenic and non-carcinogenic risk indexes of heavy metals in soils

以上结果表明经口摄入研究区土壤 Cr、As和Ni可能对人群(成人)存在健康风险,Liu等[32]的研究也得到了类似的结果,研究发现Cr和Ni对健康风险的贡献相对较高.研究表明,人体长期暴露于Cr和As会产生毒性作用,导致各种类型的癌症和畸形[33-34],Ni的暴露可能会导致过敏、神经系统疾病、心血管和肾脏疾病、肺纤维化、肺癌和鼻癌等[35],由这 3种重金属经口摄入造成的成人健康风险应该引起关注.值得注意是,在本研究中,Cd对土壤污染水平贡献最大,然而对健康风险贡献并不是最大的,这可能是因为有害重金属本身性质的差异[17,26].

2.4 基于重金属总量和生物可给性健康风险评价的比较

如表3所示,基于土壤重金属总量和生物可给性的非致癌风险指数分别为:Cr(1.00×10-1)、As(7.72×10-2)、Cd(2.84×10-3)、Pb(1.69×10-2)、Ni(4.74×10-3)、Cu(2.98×10-3)、Zn(1.03×10-3) 和Cr(6.00×10-4)、As(2.04×10-2)、Cd(1.25×10-3)、Pb(4.95×10-4)、Ni(7.31×10-5)、Cu(7.42×10-5)、Zn(9.55×10-5).综合非致癌风险指数(HI)分别为2.06×10-1和 2.29×10-2.相比之下,基于生物可给性的非致癌风险指数和综合非致癌风险指数均小于基于总量的评价结果,且它们的综合非致癌风险指数均小于 1,说明非致癌风险均不明显.基于土壤重金属总量和生物可给性的致癌风险指数和非致癌风险指数有类似的趋势,即基于生物可给性的致癌风险指数和综合致癌风险指数小于基于总量的评价结果.值得注意的是,基于总量的致癌风险指数(1.25×10-4)＞10-4,存在明显的致癌风险,而基于生物可给性的致癌风险指数(6.92×10-6)为10-4～10-6,可能存在一定的致癌风险.

表3 基于重金属总量和生物可给性健康风险评价Table 3 Health risk assessment based on total and bioaccessible heavy metals

2.5 基于生物可给性健康风险的细胞毒性验证

本文前期研究发现,污染场地土壤生物可给态重金属对人结肠上皮细胞Caco-2产生了细胞毒性,建立基于体外胃肠模拟结合人体肠道细胞(Caco-2)模型的体外方法可以准确评估其健康风险[20,36];基于生物可给性数据评定有健康风险的蔬菜并不会对人胃上皮细胞(SGC-7901)产生毒性效应[21].细胞形态及活力的变化可以准确地评估外源污染物对人体造成的健康危害,也是反映重金属造成细胞毒性的重要指标[37].

为了更加准确的评估生物可给态重金属对人体造成的健康风险,本文分析了存在致癌风险土壤的生物可给态胃相提取液(胃液)对人体胃黏膜细胞(GES-1)产生的毒性效应.胃液暴露24h后,GES-1细胞的形态及活力见图5.本研究中,细胞形态的变化与细胞活力变化一致,与对照组(CK)相比,19个土壤样品胃液暴露 GES-1细胞后均造成了毒性效应,即细胞形态发生了明显的变化,呈现出松散和不规则的形态,且漂浮和圆形细胞增多,表明细胞发生了死亡[38],细胞活力也显著下降(P＜0.05),介于 67.04%～90.38%之间.值得注意的是,土壤 S1和 S15暴露后,GES-1细胞形态发生了非常明显的改变,细胞活力也分别降低到了 67.04%和 69.56%,这与土壤 S1和S15中Cd的生物可给性较高的结果一致(图2).然而,虽然土壤S15中Cd生物可给性高于土壤S1,但细胞活力也比土壤S1高,推测各重金属元素的共同暴露的毒性效应可能是重要的原因之一[38].

图5 不同土壤胃提取液暴露24h后GES-1细胞形态及活力Fig.5 Alterations of GES-1cell viability and morphology after being exposed to the extracts of soils for 24h

3 结论

3.1 除Cd外,研究区土壤Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的平均含量均低于农用地土壤污染风险筛选值(GB 15618-2018),Cr、Cd和Zn的平均含量超出了云南省土壤背景值.Cd、Cr、As、Cu和 Zn在部分区域(分别占比87.88%、13.80%、1.14%、2.61%和3.07%)高于筛选值,可能存在污染风险.7种元素中,Cd污染受人类活动影响最大.

3.2 土壤中重金属的生物可给性:Cd(35.31%)＞As(29.44%)＞Zn(8.11%)＞Pb(3.11%)＞Cu(2.20%)＞Ni(1.56%)＞Cr(0.71%).

3.3 基于总量的健康风险评价结果表明,研究区Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的非致癌风险和综合非致癌风险HI均远小于1,7种重金属的非致癌风险不明显.此外,研究区可能存在由重金属引起的致癌风险,Cr、As和 Ni是致癌风险的主要贡献元素;同时,部分土壤样品(25.83%)的综合致癌风险指数 CR大于10-4,其致癌风险不可忽略.

3.4 基于生物可给性的CR和HI均小于基于总量的评价结果,基于总量的 CR (1.25×10-4)＞10-4,存在明显的致癌风险,而基于生物可给性的 CR(6.92×10-6)介于10-4～10-6之间,可能存在一定的致癌风险.

3.5 存在致癌风险的土壤胃模拟液对胃黏膜细胞GES-1造成了毒性效应.即细胞形态发生了变化,细胞活力也显著下降(P＜0.05).其中,土壤S1和S15胃模拟液暴露GES-1后,细胞形态发生了明显的改变,细胞活力也分别降低到了67.04%和69.56%,造成了较明显的毒性效应.