利用高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中6种喹诺酮药物的残留

张丽静，郭晓冬，韩江升

（1.威海市文登区检验检测中心，山东威海 264400；2.山东威高药业股份有限公司，山东威海 264200)

蛋白质的摄入为人的生命活动提供了丰富的氨基酸。其中，鸡蛋的食用是居民日常蛋白质的主要来源之一[1-2]。为提高蛋鸡的生存率及产蛋率，在蛋鸡养殖过程中不合规使用或者滥用药物已经成为养殖户的常规手段，也是近几年在检验检测过程中发现的常见性问题[3-7]。在这些药物中，喹诺酮类兽药是近年来人工合成的一系列新型杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广，抗菌活性强，耐药性和毒副作用小等特点被广泛应用于动物的多种感染性疾病的防治[8]。长期食用含较低浓度喹诺酮类药物的动物源性食品，容易诱导人类产生致病菌耐药性，具有潜在致畸致癌的威胁[9]。中国和欧盟都规定了在动物组织中喹诺酮类兽药的最高残留量。通过仪器快速准确地测定鸡蛋中喹诺酮类兽药的残留具有重要的现实意义。目前我国已经制定了相关的检测标准对不同种类的食品中的喹诺酮类药物进行检测。

本研究参照食品安全国家标准的检测方法，选取鸡蛋的日常监管过程中检测频率较高的6种喹诺酮类药物，整合优化检测方法，建立了一种简便、高效、准确的基于固相萃取和高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中6种喹诺酮类药物残留量的检测方法，该方法具有良好的回收率、稳定性和实用性。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡蛋，购于文登大润发商业有限公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA）；甲酸（色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司）；乙酸铵（分析纯，天津市永达化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；标准物质（购于北京坛墨质检科技股份有限公司）：恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星-D5、环丙沙星-D8、诺氟沙星-D5，质量浓度均为 100 μg·mL-1。

1.3 仪器设备

TSQ Quantum Ultra EMR System三重四极杆液相色谱质谱联用仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Shor（t335 mg，Waters公司）；PL2002，0.01 g电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；3-18KS高速冷冻离心机（SIGMA公司）；N-1300旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；N-EVAPTM 112氮吹仪（美国organomation公司）；AH-30全自动均质仪（睿科集团股份有限公司）；C18色谱柱：Hypersil gold（C18），100 mm×2.1 mm，3.0 μm（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液的配制

（1）恩诺沙星-D5、环丙沙星-D8、诺氟沙星-D5混合内标溶液的配制。分别准确吸取1 mL 100 μg·mL-1的恩诺沙星-D5、环丙沙星-D8、诺氟沙星-D5内标标准溶液，用乙腈稀释配成10 μg·mL-1的混合内标标准工作液。

（2）恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星和洛美沙星6种药物混合标准工作液的配制。准确吸取1 mL 100 μg·mL-1的恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星和洛美沙星药品标准物质，用乙腈稀释成浓度为10 μg·mL-1的混合标准工作液。

（3）6种喹诺酮药物标准曲线溶液的配制（内标法）。分别取适量的6种喹诺酮药物混合标准工作液和3种氘代混合内标标准工作液，用乙腈稀释成6种喹诺酮药物浓度为 10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和 200 μg·L-1的系列标准工作液。

1.4.2 供试样品前处理

准确称取匀浆后的蛋液5 g（精确到0.01 g），置于50 mL聚乙烯离心管中，依次加入3种氘代内标混合标准工作液50 μL，25 mL含1%甲酸的乙腈溶液，均质 2 min（转速 12 000 r·min-1），加入 5 g无水硫酸钠，盖紧旋塞剧烈振摇2 min，离心5 min（4 000 r·min-1），使有机相和水相分层。取出上层有机相于100 mL鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩至1～2 mL，放冷，用乙腈稀释至5.0 mL，摇匀。

取上述制备的提取液5 mL，通过Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Shor（t335 mg）净化，收集全部净化液，混匀，取1 mL净化液在40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL乙腈-水（1∶9，v∶v）定容，混匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤后上机检测。

1.4.3 仪器条件

（1）色谱条件。柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.2 mL·min-1；流动相：溶剂 A（含 5 mmol·L-1乙酸铵的0.1%甲酸溶液），溶剂B为甲醇；梯度洗脱条件：0～ 1 min，10%B；1～ 7 min，10%B → 35%B；7～ 9 min，35%B→ 70%B；9～ 12 min，70%B；12.1～15.0 min，10%B。

（2）质谱条件。离子源（HESI）；多反应监测（SRM）；氩气为碰撞气；碰撞气压力为0.2 Pa；样品传输管温度为350 ℃；蒸发器温度为300 ℃；鞘气流速为35 Arb；辅助气流速为10 Arb；喷雾电压为3 500 V；离子扫描模式为正离子扫描模式。

（3）离子参数的优化。分别取浓度为1 μg·mL-1的恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星和洛美沙星各药物单标溶液，采用流动注射分析法进样，用软件自带的优化功能分别对各个化合物进行优化，选择信号强度较高的两组离子对作为定性和定量离子。优化后的离子参数见表1。

表1 6种喹诺酮类药物及内标化合物的离子参数及碰撞能量

2 结果与分析

2.1 线性范围的测定

将1.4.1（3）配制的系列标准溶液上机测定，以待测化合物与内标化合物峰面积比值（y）为纵坐标，对应质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，以S/N=3确定仪器检出限。由表2可知，在10～200 μg·L-1，各种药物呈良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99。以信噪比（S/N）为3计算方法的检出限（LOD），得6种喹诺酮类药物的LOD在1～4 μg·L-1，完全满足检测需求。

表2 6种待测化合物线性方程、线性范围、R2及检出限

2.2 方法的回收率和精密度

以鸡蛋阴性样品为基质，分别添加10 μg·kg-1、80 μg·kg-1、200 μg·kg-1这 3 个浓度的喹诺酮类药物混合标准溶液，每个浓度做6个平行样品，采用内标法定量。由表3可知，在3个加标水平下，6种喹诺酮类药物的回收率为70.4%～117.8%，RSD均在15% 以内。表明本方法灵敏度高、准确性好，可以满足鸡蛋中6种喹诺酮类药物的检测需求。

表3 6种喹诺酮类药物回收率（n=6）

2.3 检测方法的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

食品安全国家标准中用到的提取溶剂主要包括两种，即酸化乙腈和磷酸盐缓冲液。实验发现用磷酸盐缓冲液作为提取溶剂时，即使用高速离心机离心后，提取液仍不易澄清，在后续过柱净化的过程中过柱非常缓慢。而用酸化乙腈提取时，后续过固相萃取柱净化就比较容易，所以本文选用酸化乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 净化材料的选择

鸡蛋是卵磷脂含量最高的食物之一，此外还含有大量的脂肪；在样品处理过程中，简单有效的净化手段对实验结果的准确性尤为关键，本实验在样品前处理过程中采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行净化，可以有效去除干扰物质，并且使待测物保持了较高的回收率。

2.3.3 定量方法的选择

为消除样品处理过程中目标物的损失和基质效应等因素的影响，本实验选用同位素内标法来进行定量，同位素内标法以待测组分和同位素内标物的响应信号比来定量，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。

3 结论

本文以酸化乙腈作为提取溶剂，以Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Short净化柱作为净化材料用于鸡蛋的前处理，结合同位素内标质谱法分析检测了6种喹诺酮类药物残留，建立了同位素质谱内标法测定鸡蛋中6种喹诺酮类药物的方法，并对方法进行了验证。结果表明，本文所建立的检测方法的线性方程、准确度、精密度和检出限等指标都满足检测需求，表明该检测方法是准确可靠、简便的，可用于日常对鸡蛋中喹诺酮类药物残留的监测分析。