关于食品中亚硝酸盐测定方法标准曲线线性范围的探讨

杨 凯，郝梦甄

（1.平邑县检验检测中心，山东平邑 273300；2.莱西市检验检测中心，山东莱西 266600）

亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，主要起到防腐保鲜、提高熟肉制品的色泽和延长腌制食品保质期的作用，在腌腊肉制品类、西式火腿、酱卤肉制品和肉灌肠类等食品中常被使用[1-2]。但食用过量的亚硝酸盐会引起中毒甚至导致死亡，研究表明成人摄入0.2～0.5 g即可引起中毒，3 g即可致人死亡[3]。很多食品企业以及食品小作坊生产者对亚硝酸盐的使用量没有正确的认识，因此加强食品中亚硝酸盐含量的检测十分重要。

《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中分光光度法测定食品亚硝酸盐含量使用的标准曲线线性范围窄，检测亚硝酸盐含量高的食品时会超出标准曲线线性范围，只能通过稀释原样品的浓度再次重复实验，这会造成实验效率低下，浪费实验试剂。因此，本文采用增大吸取标准溶液体积和提高标准溶液浓度两种方法扩大标准曲线线性范围，验证两种方法的可行性，以提高工作效率，减少试剂的浪费。

1 国标中分光光度法测定食品中亚硝酸盐存在的不足

1.1 标准曲线线性范围窄

《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中使用的标准溶液浓度为5 μg·mL-1，标准曲线的最大吸取体积是2.5 mL，按照称样质量5.0 g计算，得到该标准曲线最高点的亚硝酸盐含量为12.5 mg·kg-1[4]。但《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定，腌腊肉制品类、酱卤肉制品和肉灌肠类等的亚硝酸盐限量为30 mg·kg-1，西式火腿的亚硝酸盐限量为70 mg·kg-1，该标准曲线的线性范围不能满足日常食品中亚硝酸盐含量的检测[5]。

1.2 标准曲线的吸光度值偏低

物质吸光的定量依据为朗伯-比尔定律：A=kcL，当吸光度A=0.434时，吸光度测量误差最小[6]。如果要求测量误差小于5%，则吸光度值A=0.050～1.500；测量误差小于2%，则吸光度值A=0.155～0.950[6]。但《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中标准曲线各点对应的吸光度值为0、0.012、0.027、0.039、0.054、0.069、0.104、0.141和 0.173， 表 明亚硝酸盐的标准曲线不在最佳线性范围内，这将造成较大实验误差。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

亚硝酸钠标准溶液（1 000 μg·mL-1，北京北方伟业计量技术研究院，编号：BWZ6967-2016）；乙酸锌；对氨基苯磺酸；亚铁氰化钾；硼酸钠；盐酸萘乙二胺。

分光光度计（TU-1810）；分析天平（FA2004）；电热恒温水浴锅（LKTC-B1）。

2.2 实验方法

2.2.1 国标法

标准曲线使用浓度 （ρNaNO2）=5.0 μg·mL-1（以亚硝酸钠计），吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL 和2.50 mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL比色管中。于各管中分别依次加入对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液，加水至50 mL刻度，混匀，静置15 min，用1 cm比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线[4]。

2.2.2 改进法一

标准曲线使用浓度 （ρNaNO2）=5.0 μg·mL-1（以亚硝酸钠计），吸取0 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL、12.00 mL和14.00 mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL比色管中。对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液加入顺序、加入量、混匀后静置时间以及测量波长等条件均与2.2.1国标法完全相同。

2.2.3 改进法二

标准曲线使用浓度 （ρNaNO2）=25.0 μg·mL-1（以亚硝酸钠计），吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL、2.40 mL 和2.80 mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL比色管中。对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液加入顺序、加入量、混匀后静置时间以及测量波长等条件均与2.2.1国标法完全相同。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

横坐标为标准系列溶液中亚硝酸钠的质量（μg），纵坐标为对应的吸光度值，绘制标准曲线，如图1和图2所示。国标法的线性方程为y=0.014x-0.001 5，相关系数R2=0.999 6；改进法一的线性方程为y=0.012 5x+0.013 6，相关系数R2=0.999 0；改进法二的线性方程为y=0.012 6x+0.013 2，相关系数R2=0.999 0。通过相关系数可以看出，国标法、改进法一、改进法二线性关系良好，符合实验要求。

图1 国标法亚硝酸钠的质量与吸光度的标准曲线图

图2 改进法一和改进法二亚硝酸钠的质量与吸光度的标准曲线图

3.2 回收率的测定

随机取一实验用样品，用国标法、改进法一和改进法二分别重复实验，测得样品中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计，下同）的质量分别为1.893 μg、1.872 μg、和1.889 μg。取上述实验用样品，加入3种不同亚硝酸盐含量的标准溶液进行加标回收实验，国标法、改进法一和改进法二对每个加标实验重复测量7次，计算回收率和相对标准偏差。

由表1、表2、表3可知，国标法测得回收率为89.0%～99.0%，相对标准偏差为1.53%～2.56%；改进法一测得回收率为88.9%～96.0%，相对标准偏差为1.38%～2.56%；改进法二测得回收率为88.5%～96.5%，相对标准偏差为1.18%～3.02%。结果表明，改进法一和改进法二的加标回收率均符合要求，数据稳定性好。

表1 国标法回收率的测定

表2 改进法一回收率的测定

表3 改进法二回收率的测定

3.3 准确度和精密度的测定

将不同浓度的亚硝酸钠标准溶液使用国标法、改进法一和改进法二分别重复测量7次，比较所测得结果的准确度和精密度。由表4、表5可知，国标法测得结果的准确度为-3.32%～2.55%，精密度为1.55%～3.60%；改进法一测得结果的准确度为-2.90%～2.58%，精密度为0.73%～2.27%；改进法二测得结果的准确度为-2.13%～2.06%，精密度为0.69%～2.55%。结果表明，改进法一和改进法二的准确度、精密度均符合要求。

表4 国标法准确度和精密度的测定

表5 改进法一、改进法二准确度和精密度的测定

3.4 国标法和改进法的显著性检验

用国标法、改进法一和改进法二分别对某实验样品中亚硝酸盐含量进行检测，结果见表6。所测得的数据用软件SPSS 21.0进行显著性检验，计算显示，国标法与改进法一的P值为0.594＞0.05；国标法与改进法二的P值为0.301＞0.05。结果表明，与国标法相比较，改进法一、改进法二所测得数据无显著性差异，符合要求。

表6 3种检测方法的检测结果

4 结论与讨论

本文通过实验将《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）测定食品中亚硝酸盐含量标准曲线的线性范围扩大，以满足实验室的日常使用。结果显示，改进法一、改进法二与国标法检测结果无显著性差异，且改进法一、改进法二的准确度、精密度、回收率均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求[7]。因此，可通过增大吸取标准溶液体积或提高标准溶液浓度的方法扩大标准曲线的线性范围，从而提高工作效率，减少试剂的浪费。