几种饮食因素对尿酸酶缺失大鼠血尿酸的影响

秦 婉，綦雅琳，杲银芳，范 楠，云 宇，段为钢

(1.云南中医药大学 云南省中医药学分子生物学重点实验室，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学 基础医学院药理学系，云南 昆明 650500)

随着高尿酸血症成为危害人类健康的“第四高”[1]，通过饮食调节控制血尿酸水平成为一个热门话题[2-3].血尿酸水平受尿酸来源和排泄的影响.尿酸的来源除了自身内源性嘌呤外(约占2/3)，还与食物摄入有关；尿酸的排泄则涉及到尿液排泄(占2/3以上)和粪便排泄.尿酸为酸性物质，有研究发现摄入碱性物质有利于尿酸溶解从而促进尿酸排泄[4-6].酸碱性食物和乙醇对血尿酸的影响目前主要来自民间或临床经验，或普通动物造模后的实验结果[7]，缺乏系统的研究.基于前期的初步结果[8]，本研究采用嘌呤代谢与人类高度相似的尿酸酶缺失动物昆明-DY大鼠对以上因素进行进一步追踪，为降尿酸提供更可靠的参考.

1 材料和方法

1.1 材料

雄性昆明-DY大鼠(尿酸酶缺失大鼠)，课题组自行繁育.尿酸检测试剂盒(磷钨酸法)，南京建成生物工程研究所生产.氨丁三醇(Tris碱，>99.9%),BioFroxx(www.biofroxx.com)生产.冰醋酸(分析纯),生工生物工程(上海)股份有限公司生产.盐酸(分析纯),云南杨林开发区汕滇药业有限公司生产.碳酸氢钠(分析纯),天津市化学试剂三厂生产.无水乙醇(分析纯)和氯化钠(分析纯)天津市风船化学试剂科技有限公司生产.结晶乙酸钠(分析纯),天津市北辰方正试剂厂生产.某品牌弱碱性矿泉水(pH9.3)购于市场，符合标准GB8537.酶标仪(K6600-A),北京凯奥科技发展有限公司制造.

1.2 溶液配制

将碳酸氢钠加纯净水配置成0.5和 1.5 g/L 溶液，检测其pH(约为8.4).将氨丁三醇加纯净水拟配制成5或 15 g/L 溶液，分别加入冰醋酸或浓盐酸调节pH为8.4，制得醋酸氨丁三醇和盐酸氨丁三醇，使用时稀释10倍.醋酸钠(pH6.8)、醋酸和氯化钠直接加纯净水配置成0.5或 1.5g/L 溶液(醋酸溶液约pH3.0，氯化钠溶液pH6.5).盐酸加水配制成 0.5 g/L 溶液(pH2.0)，无水乙醇则加水配置成 4 mL/L 溶液(pH6.8).

1.3 动物实验

将 45 d 日龄的雄性昆明-DY大鼠饲养于20～24 ℃ 环境，模拟自然光照，选择血尿酸在 40 μg/mL 以上的大鼠按照繁育批次，依次分成16组，每组6只，即正常组(Normal)、醋酸氨丁三醇(TrisAc)2组(0.5和 1.5 g/L)、盐酸氨丁三醇(TrisCl)2组(0.5和 1.5 g/L)、碳酸氢钠(NaHCO3)2组(0.5和 1.5 g/L)、氯化钠(NaCl)2组(0.5和 1.5 g/L)、醋酸(HAc)2组(0.5和 1.5 g/L)、盐酸(HCl)组(0.5 g/L)乙醇(EOH)组(4 mL/L)和弱碱性矿泉水(T9.3)组.实验前后给大鼠称重，断尾取血制备血清以检测血尿酸水平.实验前后将动物单个置于代谢笼中以收集 24 h 尿液和粪便，记录 24 h 进食量和饮水量.其余时间将动物放回鼠笼，T9.3组大鼠自由饮用弱碱性矿泉水，其他组用配置好的溶液代替自由饮水.所有大鼠不限制饮食.该大鼠 1 d 内摄入 0.5 g/L 溶液的量，相当于人(70 kg)1 d 摄入 1.68 g.

1.4 尿酸检测

收集的血液样品凝固后于 3 000 g 离心 5 min 制备血清，血清直接用于尿酸检测.收集到的尿液混匀后吸取 1 mL 作为样品，用 50 mmol/L 碳酸氢钠溶液稀释20倍后检测尿酸含量.收集到的粪便则加入3倍重量的 100 mmol/L 氨丁三醇溶液，置于摇床上 140 r/min 振摇 4 h， 10 000 g 离心 5 min 取上清 1 mL 用于检测尿酸含量.尿酸的含量测定方法则按照厂家提供的说明书进行.

1.5 统计学

数据采用“均数±标准差”表示.由于动物血清尿酸以及多种指标可能存在日龄波动，以正常组指标的前后变化为对照，计算各组多个指标(血尿酸、24 h 尿量、尿液尿酸浓度、24 h 尿液尿酸总量、24 h 粪便、粪便尿酸含量、24 h 粪便尿酸总量、尿酸排泄总量、24 h 进食量、饮水量和体重)前后的变化值(即，实验 14 d 时的值-实验前的值).为了考察处理因素对体重的影响以及因体重变化带来的差异，则将“相对体重增加值”(公式1)和其他多个相对指标(24 h 相对排尿量、24 h 相对尿液尿酸总量、24 h 相对排便量、24 h 相对粪便尿酸总量、相对尿酸排泄总量、24 h 相对进食量和 24 h 相对饮水量)校正为 200 g 大鼠的指标(公式2)，在此基础上再比较各指标的前后变化值(即，实验 14 d 时的值-实验前的值).实验前后血清尿酸、尿液尿酸和粪便尿酸含量的比较采用配对t检验，其他各组之间的指标采用方法分析，若存在组间差异，两两比较采用LSD法(方差齐性)或Tamhane′s T2法(方差不齐).以P<0.05表示具有统计学差异.

(1)

(2)

2 结果

如图1所示，考察了多个因素处理14 d后对昆明-DY大鼠尿酸水平的影响(均数±标准差，n=6).其中因素如下所示：Normal，正常组，自由饮用自来水；TrisAc (g/L)，醋酸氨丁三醇；TrisCl (g/L)，盐酸氨丁三醇；NaHCO3(g/L)，碳酸氢钠；NaAc (g/L)，醋酸钠；NaCl (g/L)，氯化钠；HAc (g/L)，醋酸；HCl (g/L)，盐酸；EOH (mL/L)，乙醇；T9.3，碱性矿泉水；W0，实验前；W2，实验 14 d.*P<0.05，配对t检验.

2.1 昆明-DY大鼠血清尿酸(SUA)水平的前后变化

总体上，在实验前后正常组昆明-DY大鼠的血清尿酸水平较为稳定.不同组大鼠实验前的血清尿酸水平虽存在一定差异，但均处于较高水平.在处理因素中，口服醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、盐酸氨丁三醇(1.5 g/L)、碳酸氢钠(1.5 g/L)、氯化钠(0.5和 1.5 g/L)和盐酸(0.5 g/L)溶液能明显降低昆明-DY大鼠的血清尿酸水平.而醋酸钠(0.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)则能升高血清尿酸水平.弱碱性矿泉水对血清尿酸水平无明显影响(图1a).

2.2 昆明-DY大鼠尿液尿酸(UUA)水平的前后变化

实验前后正常组昆明-DY大鼠的尿液尿酸水平相对稳定.不同组大鼠实验前的尿液尿酸水平存在一定差异，其变异程度较血清尿酸更大.在处理因素中，醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、醋酸钠(1.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)能升高尿液尿酸水平，氯化钠则能降低尿液尿酸.有趣的是，碳酸氢钠高低浓度对大鼠的尿液尿酸水平表出现不同效果.盐酸氨丁三醇、醋酸、盐酸和弱碱性矿泉水对尿液尿酸水平无明显影响(图1b).

2.3 昆明-DY大鼠粪便尿酸(StUA)水平的前后变化

实验后正常组昆明-DY大鼠的粪便尿酸含量明显升高.不同组大鼠实验前的粪便尿酸含量存在较大差异，其变异程度较尿液尿酸更大.在处理因素中，醋酸钠(0.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)也能升高粪便尿酸含量，所有因素均不能降低粪便尿酸含量.醋酸氨丁三醇、盐酸氨丁三醇、碳酸氢钠、氯化钠、醋酸、盐酸和弱碱性矿泉水对粪便尿酸含量均无明显影响(图1c).

图1 多个因素处理14 d后对昆明-DY大鼠尿酸含量的影响

2.4 多种处理因素对昆明-DY大鼠多种指标前后变化的影响

为了进一步研究尿酸来源和排泄对血尿酸影响的可能机理，特以正常大鼠的指标变化为参照，考察昆明-DY相关因素的前后变化.由表1可见，正常昆明-DY大鼠血尿酸水平、24 h 尿量、24 h 尿液尿酸和 24 h 排尿酸总量有负向波动，其他多个指标则有正向波动.与正常组大鼠前后变化指标值相比，醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、碳酸氢钠(0.5 g/L)、醋酸钠(1.5 g/L)和乙醇(4 mL/L)可增加 24 h 尿液尿酸排泄，氯化钠(0.5 g/L)却减少 24 h 尿液尿酸排泄；醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、盐酸氨丁三醇(1.5 g/L)和氯化钠(1.5 g/L)减少了 24 h 粪便尿酸排泄，乙醇(4 mL/L)增加了 24 h 粪便尿酸排泄.从尿酸排泄总量看，醋酸氨丁三醇在不同剂量出现矛盾效应，盐酸氨丁三醇(1.5 g/L)、氯化钠(0.5 g/L)减少了尿酸总排泄量，而碳酸氢钠(0.5 g/L)、醋酸钠(1.5 g/L)、醋酸(1.5 g/L)、盐酸(0.5 g/L)和碱性矿泉水增加了尿酸排泄总量.

表1 因素对多种指标前后变化(后-前)的影响(均数±标准差，n=6)

2.5 将指标用体重校正后，多种因素对昆明-DY大鼠多种指标前后变化的影响

为了排除体重因素的干扰，将总量性指标进行体重校正，结果如表2所示.与正常组相比，醋酸氨丁三醇(1.5 g/L)、盐酸氨丁三醇(1.5 g/L)、碳酸氢钠(0.5 g/L)、醋酸、盐酸和乙醇能抑制大鼠体重增长.碳酸氢钠(1.5 g/L)能减少尿液尿酸排泄总量.醋酸氨丁三醇(0.5 g/L)、碳酸氢钠(0.5 g/L)、醋酸钠(1.5 g/L)、醋酸(1.5 g/L)和乙醇能增加相对尿酸排泄总量，而氯化钠(0.5 g/L)能减少相对尿酸排泄总量.此外，以上因素对大鼠其他多个校正指标的前后值也有不同程度的影响.为了便于观察，基于图1和表2的结果进一步定性归纳于表3中.

表2 饮食因素对多种指标用体重校正后的影响(后-前)(均数±标准差，n=6)

表3 几种因素的降尿酸效果归纳

3 讨论

昆明-DY大鼠为课题组基于SD大鼠自主研发的尿酸酶缺失大鼠，与尿酸酶缺失小鼠不同[9]，其血尿酸水平相对稳定且与人相似[8, 10-11].由于避开了造模剂的干扰[7]，可以更好地模拟人的血尿酸水平并评价食物和药物对血尿酸的影响.

从本研究结果看，有机碱氨丁三醇和无机碱碳酸氢钠都有一定的降血尿酸作用，且有机碱(醋酸氨丁三醇)更具有降尿酸的优势.醋酸钠虽可以视为碱性物质(醋酸部分可以完全分解)，但并没有降血尿酸作用，令人意外的是还能升高血尿酸.此外，氯化钠和稀盐酸竟然也具有一定的降血尿酸作用，而醋酸对血尿酸无影响.这说明有机碱和无机阴离子(氯离子和碳酸氢根离子)对降尿酸有利.同时，本研究用昆明-DY大鼠再次证明乙醇可以升高血尿酸，同时还全面增加了尿酸的排泄，由于乙醇并没有增加进食，这说明乙醇能大幅度增加体内尿酸的生成[12].值得一提的是，与文献报道不同[13]，pH为9.3的弱碱性矿泉水并未观察到降尿酸效果，可能与里面的碱性物质含量较少(偏硅酸盐约为 25 mg/L)有关，这也说明，碱性强弱只是降血尿酸的一方面，同时还必须有一定的碱性物质浓度.

由于血尿酸升高首先受害的器官是肾脏，传统降尿酸一方面要通过肾脏加快尿酸排泄，另一方面肾脏的尿酸负荷过大又对肾脏不利，这是一对矛盾[14-15].从尿液尿酸含量来看，只有氯化钠在降尿酸的同时会降低尿液尿酸含量，这似乎对肾脏有利.然而，一般认为钠离子的过多摄入也会增加肾脏的负荷，对心血管也是不利的[16].而其他具有降尿酸作用的氨丁三醇盐、碳酸氢钠和稀盐酸在剂量较低时(0.5 g/L)会增加尿液尿酸浓度排泄，而碳酸钠在剂量较大时(1.5 g/L)会减少尿液尿酸浓度.由于氨丁三醇不吸收，有机酸醋酸又可以被机体完全分解，其影响尿液尿酸的排泄属于继发作用，因此醋酸氨丁三醇本身不会带入无机离子而增加肾脏负担或心血管风险.

虽然氨丁三醇盐、碳酸氢钠、氯化钠和稀盐酸具有一定的降尿酸作用，其机理可能各不相同.根据表3的总结，可以确定是氯化钠的降尿酸作用不涉及增加尿酸排泄，继而推测可能与调节嘌呤代谢有关，而乙醇增加血尿酸的主要原因是增加了尿酸的生成，其增加尿酸排泄属于一种代偿行为[12].而醋酸氨丁三醇、盐酸氨丁三醇和稀盐酸的降尿酸机理较为复杂，可能既涉及尿酸排泄又涉及尿酸的生成，需要进一步研究.

昆明-DY大鼠 45 d 日龄的饮水量约为 60 mL/200 g，高于同龄野生型SD大鼠(40 mL/200 g)[17].因此，大鼠饮用0.5和 1.5 g/L 溶液相当日给药剂量分别为150和 450 mg/kg，约等于成人(70 kg)每天服用1.68和 5.04 g.由于氨丁三醇盐尚无口服制剂，碳酸氢钠口服降尿酸的疗效是肯定的，但要考虑钠离子对心血管的不利影响.因尿酸在高浓度碳酸氢钠中的溶解度会快速下降，因此服用碳酸氢钠时要防止尿液中尿酸结晶.日常已经有食盐摄入，人类血尿酸的维持可能已经有氯化钠的贡献，过多食盐摄入虽然对降尿酸可能有利，但会增加心血管风险. 值得一提的是，饮酒的确对控制血尿酸不利，本研究大鼠摄入的乙醇约为 1.2 mL/kg，相当于成人摄入 13.44 mL/d 乙醇(约等于饮用 34 mL 40o白酒，而此剂量很容易在餐桌上突破)，建议尿酸较高者还是戒酒为好.

在以上因素中，氨丁三醇醋酸盐有望在降尿酸治疗中发挥更大的作用.遗憾的是，虽然氨丁三醇有医用注射剂，但其醋酸盐口服制剂有待研制.