丁香脂素在Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠中的作用及相关机制

潘明明 冯燕 李青梅

丁香脂素(Syr)是一种从各种谷物和药用植物的皮质部、籽等分离出来的药理木脂素，具有抗炎和抗氧化特性[1]。有研究表明，Syr可通过激活RAW 264.7细胞中的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)，下调核转录因子(NF)-κB来减弱炎症反应[2]。本研究主要探讨Syr在Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠中的作用及相关机制。

材料与方法

1.材料：SPF级雄性Wistar大鼠70只(周龄8～10周，体重200～250 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。鸡Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)购自美国Chondrex公司；Syr(纯度≥99%，CAS号：1177-14-6)购自南京普怡生物科技有限公司；大鼠谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；大鼠白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；兔抗大鼠IL-6抗体、兔抗大鼠IL-1β抗体、兔抗大鼠TNF-α抗体、兔抗大鼠TLR4抗体、兔抗大鼠NF-κB p65抗体、兔抗大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Trizol、Prime ScriptTMRT与TB Green©Premix EX TaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司。

2.方法

(1)造模与分组：将70只Wistar大鼠安置在干净整洁、光照充足(光照周期12 h)、温度为(24±2)℃的饲养环境中适应性饲养1周。随机选择12只大鼠不做任何处理，每日正常饲养，作为Normal组。剩余58只大鼠进行造模实验，将CⅡ溶解后，加入弗氏完全佐剂，并在冰浴条件下乳化完全，配成终浓度为2 mg/ml的溶液，取0.2 ml溶液于大鼠皮下、尾根部位进行多点注射，并在第8 d将佐剂换成不完全佐剂后采用同样方法再次注射大鼠，完成加强免疫。再观察14 d，将其中造模成功且关节炎指数(AI)接近的48只CIA大鼠随机分为Control组、Syr20组、Syr50组和Syr100组，每组12只。其中Syr20组、Syr50组和Syr100组CIA大鼠分别接受Syr 20、50、100 mg·kg-1·d-1连续灌胃36 d，其中Control组和Normal组大鼠接受等体积的生理盐水连续灌胃36 d。

(2)大鼠AI评定：在Syr或生理盐水给药前1 d及给药后第6、12、18、24、30、36 d，根据文献[3]中的方法，观察大鼠四肢病变程度、关节红肿程度，并进行AI评定，AI为四肢关节炎评分之和，AI>4为造模成功。

(3)大鼠血清细胞因子水平检测：在Syr或生理盐水给药后第36 d，将5组大鼠经2%戊巴比妥钠麻醉后，迅速进行心脏采血，收集各组血清标本，在-80 ℃条件下保存。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清GSH、CAT、SOD、IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

(4)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：在Syr或生理盐水给药后第36 d，5组大鼠经方法(3)心脏采血后进行脱颈处理，收集各组大鼠踝关节组织，采用Trizol试剂从大鼠踝关节组织匀浆中提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书，使用Prime ScriptTMRT合成每种待检测因子的cDNA。以上述制备得到的cDNA为模板，通过RT-PCR试剂盒定量分析待测目的基因的表达。采用2-△△ct法计算IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平。以β-actin为内参基因，按照试剂盒说明书设置RT-PCR反应条件为：95.0 ℃，30 s预变性；95.0 ℃，10 s；60.0 ℃，30 s，进行30个循环。实验中的引物序列如下：β-actin上游：TGCTGTCCCTGTATGCCTCT,下游：GGTCTTTACGGATGTCAACG；TNF-α上游：CGATGAGGTCAATCTGCCCA,下游：CCAGGTCACTGTCCCAGC；IL-1β上游：TGAAATGCCACCTTTTGACAG,下游：CCACAGCCACAATGAGTGATAC；IL-6上游：TGCCTTCTTGGGACTGAT,下游：CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT。

(5)蛋白质免疫印迹法(Western blot)：同方法(4)收集5组大鼠踝关节组织并提取蛋白质，采用Western blot检测TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平。

结 果

1.5组大鼠不同时间AI比较：5组大鼠Syr或生理盐水给药后第6、12、18、24、30、36 d的AI比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Control组大鼠生理盐水给药后第6、12、18、24、30、36 d的AI均高于Normal组(P<0.01)。Syr20组、Syr50组及Syr100组大鼠Syr给药后第6、12、18、24、30、36 d的AI均低于Control组(P<0.05或P<0.01)。Syr50组大鼠Syr给药后第12、30 d及Syr100组大鼠Syr给药后第6、12、30 d的AI均低于Syr20组(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.5组大鼠血清细胞因子水平比较：5组大鼠血清GSH、CAT、SOD、IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Control组大鼠血清GSH、CAT、SOD水平均低于Normal组，IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于Normal组(P<0.01)。Syr20组、Syr50组及Syr100组大鼠血清GSH、CAT、SOD水平均高于Control组，Syr50组及Syr100组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于Control组(P<0.05或P<0.01)。见表2。

3.5组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平比较：5组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Control组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平均高于Normal组(P<0.01)。Syr20组大鼠关节组织TNF-α mRNA及Syr50组、Syr100组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平均低于Control组(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 5组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平比较

4.5组大鼠关节组织TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白及MMP-3水平比较：5组大鼠关节组织TLR4、NF-κB p65及MMP-3水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Control组大鼠关节组织TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均高于Normal组(P<0.01)。Syr20组、Syr50组、Syr100组大鼠关节组织TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均低于Control组(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 5组大鼠关节组织TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白及MMP-3水平比较

讨 论

关节炎指一处或多处关节出现炎症，表现为关节痛和炎症，随着年龄增长而不断加重[4-5]。本研究通过构建CIA大鼠模型，发现Syr能显著改善CIA大鼠的关节炎症状。

活性氧(ROS)在各种炎症和免疫疾病中具有重要地位[6]。在机体中，内源性抗氧化剂(GSH、SOD和CAT)可作为自由基清除剂和酶，保护机体免受氧化损伤[7]。已有研究表明，Syr能够降低氧化应激水平，达到保护组织和细胞的目的[8-9]。本研究结果显示，CIA大鼠血清抗氧化酶GSH、SOD和CAT水平较低，而Syr通过提高血清GSH、SOD和CAT水平，使CIA大鼠的氧化还原状态趋于正常。表明Syr可通过抑制氧化应激，减轻CIA大鼠的关节破坏程度。

促炎细胞因子如IL-6、IL-1β及TNF-α在实验性关节炎模型大鼠关节中大量表达。TNF-α在启动炎症和破坏滑膜、软骨中起重要作用[10]。多项体外研究表明，促炎细胞因子能刺激滑膜细胞，促进滑膜增生、调控细胞因子、产生降解酶，从而进一步加重关节破坏[11]。既往研究表明，Syr能够通过抑制NF-κB信号通路，降低促炎细胞因子如IL-6和TNF-α水平以调节炎症反应[9]。本研究结果显示，Control组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于Normal组，Syr50组及Syr100组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于Control组。Control组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平均高于Normal组，Syr20组大鼠关节组织TNF-α mRNA及Syr50组、Syr100组大鼠关节组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平均低于Control组，提示Syr可能通过抑制IL-6、IL-1β、TNF-α来实现改善CIA大鼠的炎症反应。

NF-κB蛋白通常为异源二聚体(p50和p65)形式存在，在刺激下，NF-κB的p65亚基转移至细胞核中，从而促进炎症因子的转录与表达，正向调控炎症反应。本研究中，Control组大鼠关节组织TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均高于Normal组，Syr20组、Syr50组、Syr100组大鼠关节组织TLR4、NF-κB p65、MMP-3水平均低于Control组，表明CIA大鼠NF-κB p65蛋白表达水平较高，而Syr显著抑制NF-κB p65的表达，Syr抗关节炎的分子机制至少部分是通过抑制NF-κB信号通路，从而达到抗关节炎目的。研究表明，TLR4能激活NF-κB通路[12]，进而导致炎症因子的上调。本研究中，给予CIA大鼠Syr治疗后，其关节组织TLR4蛋白水平显著下降，进一步表明Syr可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路达到治疗关节炎的目的。

MMP-3属于蛋白水解酶，通过降解细胞外基质蛋白导致韧带或软骨损伤[13]。本研究结果显示，Control组大鼠关节组织MMP-3水平高于Normal组，而Syr20组、Syr50组、Syr100组大鼠关节组织MMP-3水平均低于Control组，表明Syr作为治疗关节炎的药物存在较大的研究前景。

综上所述，Syr可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路缓解CIA大鼠的关节炎症状。