热毒宁注射液联合西药对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌体外抑菌作用实验研究*
2022-10-25肖衍豪陆巧燕谭颖华贤永嫦谢友凤杜顺霞
肖衍豪 廖 彬△ 陆巧燕 谭颖华 贤永嫦 贺 勤 谢友凤 杜顺霞 蒙 铖 张 宇
南宁市第八人民医院1检验科，2药剂科，3输血科，南宁 530001
铜绿假单胞菌是院内感染的主要致病菌，主要发生在ICU、呼吸科及烧伤科[1]。由于抗菌药物滥用、误用等不正规使用情况日趋严重，导致耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)所致感染日趋增多[2]。因此，中西药联合治疗细菌感染逐渐受到关注。热毒宁注射液由青蒿、金银花和栀子3味中药组成，具有清热、疏风、解毒作用，临床上常用于上呼吸道感染、急性支气管炎的治疗；其临床疗效确切，具有较高的安全性[3-4]。为了解决临床对CRPA治疗药物选择的难题，本实验探讨热毒宁注射液分别与头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、头孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，SCF)联合用药的体外抑菌作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
收集南宁市第八人民医院检验科微生物室2020年1月—2021年12月的临床标本，从中分离非重复株CRPA 40株。40个样本来源情况：男27人，女13人；年龄30～95岁，平均(75±14)岁；60岁以上34人，占85%。标准菌株铜绿假单胞菌ATCC27853购自国家卫生健康委临床检验中心。
1.2 培养基和抗菌药物
血液增菌培养基(杭州滨和，批号：210907)，水解络蛋白琼脂(杭州滨和，批号：210816)，血琼脂培养基(郑州安图)，麦康凯琼脂培养基(郑州安图)，生化药敏鉴定板(法国梅里埃公司)。注射用头孢他啶(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，1.0 g/瓶，批号：201260)；注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(头孢哌酮：舒巴坦=1∶1，辉瑞制药有限公司，1.0 g/瓶，批号：20201223)；热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号：210302)。
1.3 主要实验仪器
生物安全柜(海尔)、ABT半自动生化药敏鉴定仪(法国生物梅里埃公司)、显微镜(奥林巴斯)、电热恒温培养箱(上海跃进)、手提式不锈钢蒸汽消毒锅(型号：YX20B)等。
1.4 实验方法
1.4.1 细菌的检验 将临床收集到的菌株进行重新分离鉴定，按照《全国临床检验操作规程》第三版标准进行分纯培养、鉴定和药敏实验。
1.4.2 实验菌液配制 取经过分纯培养的菌落1～2个，用5 mL生理盐水配制成0.5麦氏浊度菌悬液，再用MH肉汤稀释10倍备用，稀释的菌液应在15 min内接种完毕。
1.4.3 确定单药最低抑菌浓度 对热毒宁注射液进行浓度递减实验，确定热毒宁的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：取12支试管按1～12顺序进行编号，依次在1～12号试管中加入不同浓度的热毒宁溶液，用微量移液器向每支试管中加入实验菌液，保证最终试管内的接种浓度为5×105CFU/mL。置于35℃电热恒温培养箱中培养24 h。
分别对头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦进行倍比稀释实验，确定头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦的MIC：分别取2组各12支试管按顺序编号，在2～12号试管中加入1 mL的MH肉汤，分别在1号和2号试管中加入头孢他啶(或头孢哌酮/舒巴坦)1 mL(浓度为4096 g/mL)，从2号试管开始对倍稀释直至12号试管，用微量移液器向1～12号试管中分别加入实验菌液，保证最终试管内的接种浓度5×105CFU/mL。置于35℃电热恒温培养箱中培养24 h。
1.4.4 确定联合用药稀释度 采用微量棋盘稀释法分别配制不同浓度的热毒宁+头孢他啶、热毒宁+头孢哌酮/舒巴坦肉汤。依据96孔板自带的孔位编号，在横排中，将头孢他啶(或头孢哌酮/舒巴坦)按12→1方向进行倍比稀释；在纵列中，将热毒宁按A→H方向进行梯度稀释，同时保证第H排只有头孢他啶(或头孢哌酮/舒巴坦)1种药，第1列只有热毒宁1种药物。最后加入实验菌液，保证最终接种浓度为5×105CFU/mL，置于35℃电热恒温培养箱中培养24 h。
40株CRPA均与标准菌株ATCC27853平行操作。
1.5 结果判读
经培养后观察各孔位的浑浊情况，澄清表明细菌生长受抑制，浑浊表明细菌生长。以无细菌生长的最低药物浓度为MIC。
1.6 联合用药的部分抑菌浓度指数计算
部分抑菌浓度(fraction inhibitory concentration，FIC)指数=A药联合的MIC/A药单用的MIC+B药联合的MIC/B药单用的MIC。相互作用解释：FIC指数≤0.5为协同作用；0.5
2 结果
2.1 3种药物单用对标准菌株ATCC27853及40株CRPA的MIC值
根据上述热毒宁浓度递减实验结果，最终确定热毒宁对ATCC27853的MIC为400 μL/mL；根据上述头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦浓度倍比稀释抑菌实验结果，头孢他啶对ATCC27853的MIC为16 μg/mL，头孢哌酮/舒巴坦对ATCC27853的MIC为32 μg/mL。
40株CRPA中，热毒宁MIC集中于500 μL/mL，共有31株(77.5%)；头孢他啶MIC集中于32 μg/mL～64 μg/mL，共有31株(77.5%)；头孢哌酮/舒巴坦MIC集中于64 μg/mL～128 μg/mL，共有35株(87.5%)。见表1。
表1 热毒宁、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦单独用药的MIC
2.2 热毒宁与头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦联合用药结果
热毒宁与头孢他啶联用：ATCC27853的热毒宁MIC为200 μL/mL，头孢他啶MIC为4 μg/mL；40株CRPA中，有30株(75.0%)CRPA的热毒宁MIC位于250 μL/mL～350 μL/mL，有26株(65.0%)CRPA的头孢他啶MIC位于8 μg/mL～16 μg/mL。
热毒宁与头孢哌酮/舒巴坦联用：ATCC27853的热毒宁MIC为150 μL/mL，头孢哌酮/舒巴坦MIC为8 μg/mL；40株CRPA中，有28株(70.0%)CRPA的热毒宁MIC位于250 μL/mL～350 μL/mL，有34株(85.0%)CRPA的头孢哌酮/舒巴坦MIC位于8 μg/mL～32 μg/mL。
热毒宁与头孢他啶联用FIC指数：FIC≤0.5为2.5%(1/40)，0.5
表2 热毒宁与头孢他啶联合用药的MIC和FIC指数
表3 热毒宁与头孢哌酮/舒巴坦联合用药的MIC和FIC指数
3 讨论
碳青霉烯类抗生素被认为是治疗铜绿假单胞菌感染的强效药物，但在过去的几年里，世界各地均监测到碳青霉烯类抗生素耐药率的上升[5]。中药具有应用方便、经济安全的优势，且许多中药具有抗菌活性，同时不良反应小、不易产生耐药性，故从天然药物中寻找高效、低毒的抗菌药物，对解决细菌耐药性具有重要意义[6-7]。
热毒宁注射液以青蒿为君药，能清热凉血、透散肌表；金银花为臣药，擅清热解毒、透散表邪，协助增强青蒿清热透散之力；栀子为佐药，具有解毒、清热、凉血、清泄心肺胃的功效[8]。研究[9]表明，热毒宁注射液具有较好的解热抗炎功效。本实验中，热毒宁注射液联合头孢他啶时，共有30株(75.0%)CRPA的热毒宁MIC降至250 μL/mL～350 μL/mL，联合用药后头孢他啶MIC均较单独用药时下降50%及以上，与刘佳[10]的研究结果相似。当热毒宁联合头孢哌酮/舒巴坦时，有28株(70.0%)CRPA的热毒宁MIC降至250 μL/mL～350 μL/mL，联合用药后共有34株(85.0%)CRPA的头孢哌酮/舒巴坦MIC较单独用药时下降50%及以上，与林昱等[11]研究报道结果相似。此外，热毒宁注射液与头孢他啶联用以相加(67.5%)和无关(30.0%)作用为主；热毒宁注射液和头孢哌酮/舒巴坦联用以相加(70.0%)和无关(20.0%)作用为主；热毒宁注射液与上述2种抗生素联用均未发现拮抗作用，联合用药抑菌作用均表现良好。
综上所述，热毒宁与头孢他啶和头孢哌酮/舒巴坦联合应用后，其抑菌所需浓度明显低于单独用药浓度；这可能得益于中药多靶点、多途径的作用特点，但具体抑菌机制需进一步研究。此外，本次实验所用药品均为注射制剂，其在体内的抑菌效果如何仍有待进一步研究验证。
