鸡毒支原体灭活疫苗效力检验气囊注射攻毒方法的研究

魏 津，刘 博，马 欣，王 甲，赵浩然，刘元杰，冯 妍，刘业兵，罗玉峰

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡毒支原体(Mycoplasmagalliscepticum，MG)是致病性最强、引起损失最大的禽支原体，主要导致鸡慢性呼吸道疾病(Chornic respiratory disease，CRD)[1]，以呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕为主要症状，部分表现为结膜炎、眶下窦炎。CRD虽然致死率不高，但严重影响家禽产蛋率、孵化率和饲料转化率，给养殖企业造成重大经济损失[2]。临床中由于长期使用或滥用抗菌药物，导致鸡毒支原体耐药菌株不断增加，给通过药物防控该病带来困难，甚至危及食品安全[3]，因此疫苗免疫是防控该病的重要手段，国内市场上占主导地位的是鸡毒支原体灭活疫苗[4]。效力检验是评价疫苗质量的最核心手段，《中国兽药典(2020年版三部)》中收录的该疫苗质量标准的效力检验采用免疫攻毒法，攻毒方式为喷雾[5]。该方法需要制备500-600 mL的攻毒培养物，经过菌种复苏、扩大培养、活菌预计数和攻毒菌液计数等步骤，且活菌计数周期长，攻毒感染剂量不易控制，对操作人员的经验和技术要求高。同时，攻毒结果易受器械设备的影响较大，喷雾操作后消毒难度较大，存在生物安全隐患。为此，本研究通过将鸡毒支原体检验用攻毒菌种制备成方便使用和保存的冻干攻毒培养物，进行气囊注射攻毒试验和比较研究，旨在建立一种更加科学准确、操作简便的攻毒方法，也为相关标准品的研究制备提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 鸡毒支原体R株(CVCC 1651)由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应。

1.2 材料与试剂 硫乙醇酸盐流体培养基(TG)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、12%明胶40%蔗糖保护剂均购自北京中海生物科技有限公司。圆形灭菌滤纸片，购自oxoid公司。鸡毒支原体抗血清，实验室保存。CM液体和固体培养基由实验室自制。

1.3 实验动物 SPF鸡购自北京勃林格殷格翰有限公司。

1.4 方法

1.4.1 冻干培养物制备

1.4.1.1 菌种扩繁 将-20 ℃保存的鸡毒支原体R株冻干菌种用1 mL CM液体培养基复溶后，按一定比例接种到CM液体培养基中37 ℃培养24 h后，按一定比例接种培养基连续传代，第3代菌液经纯粹检验和活菌计数后待用。

1.4.1.2 分装冻干 取生长良好，有轻度混浊，无沉淀的第3代菌液，按总体积10%比例加入保护剂，充分混匀后分装至安瓿瓶内冻干，冻干后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 冻干培养物的鉴定

1.4.2.1 常规检验 对冻干培养物进行性状、纯粹检验、剩余水分、真空度、培养特性和活菌计数检验。

1.4.2.2 特异性试验 代谢抑制试验：用CM液体培养基对鸡毒支原体R株培养物进行10倍系列稀释到10-5，取1 mL稀释好的菌液，加入含鸡毒支原体抗血清0.05 mL(终浓度为5%)的CM培养基1 mL，同时设加阴性血清的小管为阳性对照，空白培养基作为阴性对照，置于培养箱37 ℃培养14 d，观察培养基颜色变化。生长抑制试验：取直径6 mm的圆形灭菌滤纸片，用未经稀释的鸡毒支原体抗血清湿透后，放入无菌平皿内，置于2～8 ℃干燥待用。将R 株培养物各0.3 mL分别接种到2个CM固体培养基，均匀铺开，放置37 ℃培养箱使培养基表面稍干燥。用灭菌小镊子夹取抗血清纸片贴在固体培养基表面靠中间位置，另一个固体培养基贴空白纸片作为对照，置于培养箱37 ℃培养10 d后在显微镜下观察结果。

1.4.3 瓶间活菌数均一性试验 随机抽取10瓶冻干培养物，使用颜色变化单位(简称CCU)分别对其进行活菌计数，比较活菌数的差异。

1.4.4 气囊注射攻毒方法的建立 将冻干培养物复溶后，根据冻干后活菌计数结果进行10倍倍比稀释为10-1、10-2，将原液和每个稀释度进行活菌计数后分别取0.2 mL和0.4 mL气囊注射10只75日龄SPF鸡。制备鸡毒支原体R株的培养物550 mL，进行活菌计数后在隔离器内喷雾攻击10只75日龄SPF鸡。另取10只鸡，5只气囊注射0.4 mL培养基作为气囊注射对照组，5只用培养基进行喷雾作为喷雾对照组。7 d后记录活菌计数结果，确定实际攻毒剂量。14 d后将所有组别的鸡剖检，记录气囊病变分数结果，气囊病变记分标准参照《中国兽药典(2020年版三部)》“鸡毒灭活疫苗质量标准附注”[5]。将气囊注射与喷雾攻毒的结果进行单因素方差分析。

1.4.5 气囊注射攻毒方法的评价 用喷雾和1.2.4项确定的气囊注射两种攻毒方法同时对5家企业5个批次的疫苗进行两次效力检验。每批疫苗取1瓶摇匀后免疫56日龄SPF鸡8只，1 mL/只。免疫30天后攻毒，比较两种方法的对照组气囊病变分数情况和平均气囊保护率，记分标准及计算方法参照《中国兽药典(三部)》“鸡毒灭活疫苗质量标准附注”[5]，评价利用气囊注射攻毒方法对灭活疫苗效力检验的可行性。

2 结果与分析

2.1 常规检验 冻干的165支菌种中，5支无辉光，160/165呈现白色或紫色辉光，真空度良好。纯粹检验结果符合规定，水分测定结果为0.7%、1.4%、0.2%、0.7%，均不超过4.0%。活菌计数结果为109CCU/mL，培养菌落呈典型的“油煎蛋”状外观，符合培养特性的规定。

2.2 特异性试验 代谢抑制试验：加抗血清的培养基小管未变色，加阴性血清的培养基小管变黄，培养基对照管未变色。生长抑制试验：抗血清纸片周围无菌落生长，出现大于2.0 mm的抑菌圈；空白纸片的平板有菌落生长，没有抑菌圈，说明该菌种为鸡毒支原体，符合规定。

2.3 瓶间活菌数均一性试验 10瓶冻干培养物活菌数均为109CCU，变异系数为0%。

2.4 气囊注射攻毒方法的建立 喷雾攻毒用培养物活菌数为109CCU/mL，冻干培养物活菌数为109CCU/mL，稀释后复数结果10-1、10-2两个稀释度对应的活菌数为108CCU/mL和107CCU/mL。不同攻毒方法的气囊病变分数结果见表1：气囊注射0.2×107CCU和0.4×107CCU的培养物，6/10和5/10分别出现2分以上的典型气囊病变，不符合菌种毒力标准的发病要求[6]；喷雾组方差大于气囊注射的6个实验组(方差反映一组数据的离散程度)，说明喷雾组分数差异大，感染剂量不均一。将不同攻毒方法的病变分数进行单因素方差分析，结果见表2：在显著水平α=0.05时，气囊注射0.4×109CCU、0.2×108CCU和0.4×108CCU的F值均大于F临界值，P值小于0.05，与喷雾结果差异显著；气囊注射0.2×109CCU的F值均小于F临界值，P值大于0.05，与喷雾结果无显著差异。

表1 不同攻毒方法的气囊病变分数结果Tab 1 Air sac leision scores of different challenge methods

表2 不同剂量气囊注射与喷雾攻毒方法气囊病变结果方差分析Tab 2 Variance analysis of aerosol challenge and air sac injection with different doses

2.5 气囊注射攻毒方法的评价 2.4项结果表明，气囊注射0.2 mL 109CCU/mL的冻干培养物与现行喷雾方法无显著差异，选用该攻毒剂量进行气囊注射攻毒。两次效力检验攻毒对照组气囊病变分数结果见表3：两次气囊注射攻毒分数无明显差异，和喷雾方法相比，分数也无明显差异。

表3 不同攻毒方法两次效力检验的气囊病变分数Tab 3 Air sac leisions scores of different challenge methods in two potency tests

两次效力检验结果比较见表4。结果表明，5家企业5批产品采用两种攻毒方法进行效力检验平均气囊保护率无明显差异，检验结果符合率100%。

表4 不同攻毒方法两次效力检验的结果比较Tab 4 Comparative results of different challenge methods in two potency tests

3 结论与讨论

目前国内外鸡毒支原体灭活疫苗效力检验均采用喷雾攻毒法。在鸡毒支原体的研究过程中，有多种方法用于鸡的攻毒感染试验，包括鼻、眼、窦和气管内的接种[7]，气囊注射[8]、气雾攻毒[9]、肺内注射[10]。据赖月辉等2018年报道[11]气囊攻毒的病变比肺内攻毒出现的病变更典型，效果更好，具有良好的重复性。采用气囊注射具有易定位、易操作和接种量更精确的优点，直接感染气囊，避免了喷雾攻毒试验鸡由于吸入量可能不同导致感染剂量不均一，发病情况差异大的问题。同时，采用注射攻毒，所需培养物量少，易于制备，并利于隔离器消毒处理，大大降低了生物安全隐患。

采用新鲜培养物攻毒，需要每次预培养摸索攻毒菌株在该批培养基的生长曲线，并据此重新培养进行攻毒，两次培养条件和结果很难达到完全一致，有可能会对效力评价结果产生一定影响。本研究制备了冻干攻毒用培养物，保存于-80 ℃，通过攻毒试验确定了攻毒剂量，应用于两次鸡毒支原体疫苗效力检验中，结果表明，在此段时间内活菌数和毒力均保持稳定，且效力检验结果与喷雾方法无显著差异。将其应用于效力检验将减少复苏强毒菌种和再培养等步骤，降低工作量。每次采用同一批攻毒用冻干培养物，提高了检验结果的准确性和可重复性，提升了检验效率，为研制攻毒用标准品提供实验依据。

未来可通过不同保存条件、保存时长内活菌数和毒力稳定性的监测，确定本研究中冻干培养物的保存要求和时限。同时可考虑筛选一种新的冻干保护剂，提高其在不同温度环境存放的稳定性并延长保存期，实现对外供应，为提高鸡毒支原体疫苗效力评价水平奠定基础。