荷兰马齿苋种子脂肪酸活性成分的分析

刘圆圆，孙宇飞，赵承晓，赵蕊，于永忠

作者单位：黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319

马齿苋（Portulaca oleracea L.；Purslane）是马齿苋科马齿苋属的一年生草本植物。在《中国药典》和世界卫生组织（WHO）提倡的“地中海式饮食”的膳食指南中均认定马齿苋为药食两用植物［1］。马齿苋广泛分布于除高寒地区的外温带和亚热带地区［2］，适应环境能力极强［3］且耐盐碱［4］。马齿苋全草均可入药，有清热利湿、消肿解毒、消炎［5］利尿等功效。研究表明，马齿苋除了包含多种营养物质如去甲肾上腺素、胡萝卜素、多糖和黄酮，还具有多种有效成分如不饱和脂肪酸［6-7］，以及维生素A和维生素E，被誉为“天然抗生素”之一。1995年，我国首次试验种植荷兰马齿苋。2008年，在北京奥运会期间专供各国运动员食用的奥运蔬菜。随即全国开始种植，形成规模种植的部分地区有山东寿光，浙江丽水，河南商丘，湖北武汉等等。2012年，我们从国家蔬菜工程技术研究中心（京研）引进荷兰马齿苋，在黑龙江省大庆市试验种植并加以改良，获得了适合当地的丰产品种，在产量、品质等方面均优于野生品种，但在有效成分含量及功效方面有待于深入研究。

马齿苋种子中的天然脂肪酸种类蕴含丰富，其中主要包括单不饱和脂肪酸（如油酸、棕榈酸等）和多不饱和脂肪酸（如ɑ-亚麻酸、亚油酸等）。从分子构成上讲，多不饱和脂肪酸又分为ω-3多不饱和脂肪酸及ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3不饱和脂肪酸经体内转化为二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），主要作用是降低血管中胆固醇含量，保护心血管健康［8］、阻止肠道疾病的发生［9-11］以及辅助精神病［12］和癌症的治疗［13］。由于人体不能合成ω-3不饱和脂肪酸，需从天然食物中获取。自然界含ω-3不饱和脂肪酸丰富的动植物有深海鱼类和油料作物等，相比之下，马齿苋不饱和脂肪酸的获取要比深海鱼类和一些动植物等来源方便、价格低廉。基于马齿苋ω-3多不饱和脂肪酸的开发利用价值，越来越多的国内外研究学者不断探索其提取工艺，目前已有物理压榨法［14］、超临界二氧化碳提取法［15］、超声提取法［16］、化学溶剂浸提法［17］和生物酶法［18］等。此前，有数据表明，马齿苋中的ω-3不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的16.9%［13］。为探究荷兰马齿苋的情况，本研究自2020年6―11月对荷兰马齿苋种子脂肪酸进行了提取、鉴定与对比分析。

1 材料和方法

1.1 材料荷兰马齿苋种子来源于天然药物功能研究实验室，经黑龙江八一农垦大学引进并人工种植培育的荷兰马齿苋，精心挑选出茎秆壮实且枝叶肥厚的优质荷兰马齿苋采摘收集种子。

1.2 主要试剂和仪器分析级甲醇、石油醚、三氟化硼（BF3）、正己烷（德州润昕实验有限公司）；37种脂肪酸混合标准品（青岛科创质量检测有限公司）；内标十九烷酸甲酯（sigma公司）；Trace1310ISQ气相色谱质谱联用仪（美国赛默飞世尔科技）；干热烘箱（上海森信实验仪器有限公司）；中药材粉碎机（江阴市宝利机械制造有限公司）；索氏提取器（上海极恒实业有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 荷兰马齿苋种子粉的制备采集约1 kg的荷兰马齿苋种子，洗涤后置于干燥箱中烘干水分，用中药材粉碎机粉碎成种子粉装瓶备用。

1.3.2 脂肪酸的提取取净重78 g的种子粉末放入装有石油醚的索氏提取器中，启动加热装置使石油醚不断回流浸提。浸提结束后，回收石油醚，烘干后放入干燥器内冷却。重复以上操作直到提取物恒重，得荷兰马齿苋种子油。上述实验重复3次，计算荷兰马齿苋种籽的出油率。之后，将粗提物样品委托青岛科创公司进行定量分析检测。

1.3.3 脂肪酸分析检测

1.3.3.1 样品处理将粗提物样品称重放入到离心管中，加入氢氧化钠-甲醇溶液；以十九烷酸甲酯做内标，将离心管水浴后，等温度降到室温，加入三氟化硼-甲醇溶液，水浴冷却后用适量正己烷萃取，取正己烷层过膜上机。

1.3.3.2 色谱分析本实验选择TG-5MS（30 m×0.25 m×0.25 μm）色谱柱，加热程序为：80℃，1 min，以10℃/min速率到200℃，以5℃/min的速率升到250℃，又以2℃/min速率升到270℃，停留检测。其中进样口温度为290℃，载气流速为1.2 μL/min，采取不分流进样，开阀时间为1 min。质谱条件为离子源温度280℃，传输线温度280℃，溶剂延迟时间5 min，扫描领域扩大为30～400 amu，离子源为EI源，70 eV。

2 结果

2.1 荷兰马齿苋种子及其油脂产率荷兰马齿苋叶片较大且肥厚，茎秆粗壮直立，果实边成熟边开裂，极容易散落在周围土壤中生长出新的植株，荷兰马齿苋种子呈黑色圆饼状，粒径虽小但产量较大，平均每株植株产种子数约14 400粒，千粒种子约重0.48 g，发芽力保持持久。经过索氏提取法提取的荷兰马齿苋种子油，呈淡黄色半透明油状，具有植物油的芳香味。经计算出油率为（20.36±0.12）%。

2.2 荷兰马齿苋种子脂肪酸的组成和相对含量经甲酯化得出来的荷兰马齿苋总脂肪酸运用气相色谱-质谱联用技术分析，共检测出6种主要成分。其不饱和脂肪酸组成如表1所示。各脂肪酸质谱图如图2所示。

图2 荷兰马齿苋种子脂肪酸质谱分析结果：A为棕榈酸；B为硬脂酸；C为α-亚麻酸；D为顺-11-二十碳烯酸；E为山嵛酸；F为亚油酸

表1 GC-MS分析荷兰马齿苋不饱和脂肪酸组成

各色谱对应峰值经过质谱图库检索定性分析，按照数理统计的方法，确定荷兰马齿苋种子中的各脂肪酸成分含量的相对百分比情况，可以得出α-亚麻酸、亚油酸以及硬脂酸之间的相对百分含量差异有统计学意义。此外，我们比较了两种马齿苋种子中脂肪酸成分。比较结果见表2。罗马尼亚马齿苋种子脂肪酸［7］的n-6与n-3比值为1.78，而荷兰马齿苋种子脂肪酸的n-6与n-3比值为3.76。

表2 两种马齿苋种子中脂肪酸成分比较/%

2.3 荷兰马齿苋籽油多不饱和脂肪酸含量丰富本实验还比较了荷兰马齿苋籽油中脂肪酸的组分与其他几种常见类型植物油之间的差异。荷兰马齿苋籽油含α-亚麻酸和亚油酸n-6与n-3的比值为3.76（表3）。

表3 14种植物籽油脂肪酸相对含量的比较/%

3 讨论

本实验采用索氏提取法对荷兰马齿苋种子脂肪酸进行提取，并对粗提物进行气相色谱-质谱检测分析。截至目前，已有多种提取植物种子油的方法，也有多种方法混用的（如核桃油是先通过萃取器再经过压榨机榨取的［14］）。单一方法技术提取效率也很高，比如金银花种子通过响应面分析法优化超声提取［20］；元宝枫种仁油通过水酶法提取［21］。但是由于荷兰马齿苋的种子太小，不适合用物理压榨法提取；虽然也有采用响应面分析法提取的，但主要是为了获取马齿苋中的多糖成分［22］；而水酶法提取率较低且在待检过程中要保持乳化体系的稳定性，否则一旦形成稳定的乳状液，要破坏其稳定性，达到分离相十分困难。综合判断，本实验选用索氏提取法，以石油醚作为提取剂，使实验不仅操作简单，而且提高了脂肪酸提取率，也减少杂质成分干扰。

荷兰马齿苋种子，经过气相色谱-质谱联用仪检测分析，发现与Stroescu所提取的罗马尼亚马齿苋种子脂肪酸组成成分差异明显（表2），反映在α-亚麻酸的检出率方面差异极明显。结果表明，荷兰马齿苋种子中不含反油酸且油酸的含量极低，但亚油酸的相对百分含量较高，我们分析可能是由于马齿苋在不同环境下生长造成了这种差异性。尽管如此，针对荷兰马齿苋种子脂肪酸成分定量分析仍需要多批次重复验证。应当考虑到种子批次、营养条件、收集处理方法等客观因素的影响，因此，需要进行多因素的统计学分析如多元回归分析以最终评价。

总之，本实验采用索式提取法提取荷兰马齿苋种子脂肪酸，提取率为（20.36±0.12）%；获得的不饱和脂肪酸种类较多且占脂肪酸总量的94%以上。脂肪酸产物经计算n-6与n-3的比值为3.73，贴近我国营养标准（中国营养学会建议成人脂肪摄入n-6、n-3比例为4∶1～6∶1为宜）。后续研究将围绕荷兰马齿苋功能进行深入探索。本研究证明有机培植的荷兰马齿苋在食品、药品、保健品以及动物饲料等方面都具有广阔的开发利用前景。