抗中心粒细胞胞浆抗体检测在儿科疾病中的应用

康郁林

上海市儿童医院 上海交通大学医学院附属儿童医院肾脏风湿科（上海 200062）

抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一类以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体，是诊断系统性小血管炎的重要标记物。目前，ANCA 的检测手段日趋先进，灵敏度和特异度较前大幅提高，为ANCA相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)的早期诊治提供了可靠保障。为进一步了解ANCA 在儿科疾病中的临床意义，本文将重点介绍ANCA的概况、检测方法及其在儿科疾病中的应用。

1 ANCA简介

ANCA最早于1982年在节段坏死性肾小球肾炎患者的血清中被发现，但当时并未引起学界重视，直至1985年Van der Woude 发现系统性血管炎患者也存在类似的抗体[1]。然而，早年对ANCA 的临床意义缺乏认识，例如1990年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)制定的血管炎分类标准中，并未将ANCA 纳入其中[2]。随着对ANCA认识的加深，2012 年Chapel Hill 会议(CHCC)将ANCA 纳入了血管炎分类标准，并提出了新的分类方法，将肉芽肿性血管炎 (granulomatosis with polyangiitis，GPA)、显微镜下血管炎 (microscopic polyangiitis，MPA) 和嗜酸性粒细胞肉芽肿性血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis，EGPA)归属为AAV[3]。在2022 年ACR/欧洲抗风湿病联盟(EULAR)提出的MPA、GPA 和EGPA 分类标准中，ANCA已成为系统性小血管炎分类标准中的重要标志物[4-6]。

ANCA 的靶抗原包括蛋白酶3(proteinase 3)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、乳铁蛋白(lactoferrin，LF)、弹性蛋白酶(elastase，ELA)、溶酶体(lysozyme，LYS)、天青杀素(azurocidin，AZU)和杀菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)等等。ANCA 包括胞浆型(cytoplasmic ANCA，c-ANCA)、核周型(perinuclear ANCA，p-ANCA)和非典型(atypical ANCA，a-ANCA)。其中c-ANCA、p-ANCA的靶抗原分别是PR3和MPO。其中，PR 3 一种丝氨酸蛋白酶，相对分子质量约为29 000，主要存在于中性粒细胞胞浆的嗜天青颗粒中，也可存在于中性粒细胞表面及其分泌的微囊泡中。MPO 是一种相对分子质量150 000 的血红素蛋白酶，由2条α链和2条β链组成，粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内[7]。

2 ANCA的产生与致病机制

ANCA主要是IgG类抗体。c-ANCA和p-ANCA成熟演化过程可能经历了3 个阶段：由于IgG 可变区编码基因的变异使其与靶抗原的结合能力显著增强；抗原表位拓展(epitope spreading) 使得靶器官更易受损；存在有利于MHC-II 形成的特殊等位基因[8-11]。迄今，关于ANCA的形成机制仍不明确，目前主要包括4 种学说。①抗PR 3 的c-ANCA 形成与自身抗原互补蛋白相关。该学说认为PR3编码DNA的反义链，或者与编码PR3反义链DNA序列相似的细菌刺激机体产生c-ANCA。②分子模拟学说。金黄色葡萄球菌和痢疾阿米巴的部分抗原与PR3、MPO类似，诱导机体产生自身抗体。③凋亡受阻学说。中性粒细胞自身凋亡受阻，导致细胞抗原暴露的机会增加，从而刺激B 细胞产生更多的抗体。④中性粒细胞胞外陷阱学说(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs 是中性粒细胞释放至胞外的纤维状结构，是一种抵抗微生物的免疫防御机制，该结构上附有的颗粒蛋白PR3和MPO可被抗原递呈细胞处理，从而促进自身抗体的产生。ACNA 相关性血管炎患者中，上述四种机制可能同时存在[7,12]。由此可知，ANCA的形成机制方面是值得进一步研究的方向。

迄今，AAV 中的发病机制仍未完全阐明，但目前研究提示ANCA参与了AAV的起病。体外研究发现ANCA可诱导中性粒细胞活化，发生呼吸爆发与脱颗粒，大量释放氧自由基、蛋白酶等物质损伤血管内皮细胞。此外，活化的中性粒细胞可诱导产生NETs，进一步损伤血管[13]。

3 ANCA检测方法

随着免疫学技术的进展，国内外目前检测ANCA 的方法较多，主要包括间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光免疫法(chemiluminescent immuno-assays，CLIA)和荧光酶免疫法(fluorescent-enzyme immunoassays，FEIA)等，但目前国内外临床广泛使用的检测技术主要为IIF法和ELISA法。

IIF 法检测ANCA，这是临床上较早用于检测ANCA 的手段，也是当今常用的检测技术之一。乙醇或甲醛固定中性粒细胞后，IIF 法检测p-ANCA、c-ANCA 和a-ANCA。p-ANCA 的特点是在多形细胞核周围可见免疫荧光环绕，这是针对MPO 的抗体；c-ANCA 的免疫荧光呈颗粒状分布于细胞的胞浆中，这是针对PR 3 的抗体；而a-ANCA 的免疫荧光在细胞核和胞浆中均可见，即同时具备p-ANCA和c-ANCA的荧光特点。IIF法检测ANCA的灵敏度、特异度分别是67%～78%和93%[14]。由于人工判别免疫荧光强度带有一定的主观性，目前部分商业公司已开发了自动的阅片系统，即可避免主观性，也可提高工作效率。但是，IIF 法的假阴性率较高，为了弥补其中的不足，ELISA 法已被开发应用于临床诊断，并已作为常用的检测方法[15]。

由于p-ANCA和c-ANCA靶抗原的纯化技术得到提高，因此，抗原检测成了另一种可靠的检测技术。经历30余年的发展，检测ANCA的ELISA技术已经发展到了第三代，相对于第一代和第二代，能更充分暴露抗原表位，有更高的表位结合效能，从而大幅提高了检测方法的灵敏度(80%～97%)和特异度(约96%)。研究表明，同时开展IIF法和ELISA法检测ANCA，其灵敏度和特异度将达到92%和99%[1]。因此，联合两种方法进行检测，是当今众多医疗机构采用的ACNA 检测方法。然而，随着免疫学检测手段的进步，2019年中国免疫学会临床免疫学分会制定的《抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法在诊断肉芽肿性血管炎和显微镜下多血管炎中应用的专家共识》推荐：可采用ELISA、化学发光免疫法和多重微珠流式免疫荧光法等先进的抗原特异度免疫学方法定量检测MPO 和PR 3，作为针对疑似AAV 的筛查方法，如果检查结果阴性或者弱阳性，但临床仍高度怀疑AAV 时，可使用IIF 或其他抗原特异度免疫学方法做确认试验[16]。

4 ANCA在儿科风湿免疫性疾病中的应用

在儿科的日常临床诊治工作中，对于反复发作的鼻窦炎和耳炎、有系统特征的皮肤型血管炎、声门下气管狭窄、视网膜血管炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、视神经炎、慢性上呼吸道破坏性疾病、肺出血、肺肾综合征和急进性肾小球肾炎等疾病，或者反复不明原因的发热，或多脏器累及性疾病，开展ANCA 检测有助于早期发现AAV[16]。

4.1 ANCA相关性血管炎

AAV 是一种寡或无免疫复合物沉积的坏死性血管炎，主要累及中小血管。2012 年CHCC 会议的血管炎分类标准将ANCA纳入了诊断标准，并更新了血管炎的命名方法，将AAV 可分为3 类：GPA、EGPA和MPA，前两者是肉芽肿性血管炎，后者为非肉芽肿性血管炎。为提高疾病诊断的灵敏度和特异度，2022年ACR/EULAR提出了新的血管炎分类标准，见表1。该标准通过评分的方式，赋予疾病临床表现、影像学、病理和实验室检查结果一定的权重分值，为血管炎患者提供更加有力的分类标准。在这一分类标准中，ANCA在AAV中的诊断价值得到了充分显现。该标准基于成人患者数据制定，但对儿童血管炎的诊断亦具有良好的参考价值。儿童AAV以GPA 和MPA 为主，关于儿童AAV 的流行病学资料较缺乏，现有的数据主要来自欧洲：法国约为0.45/100万，瑞典约为1.4/100万，加拿大6.39/100万。儿童AAV 多见于12～14 岁，女孩多见，肾脏受累较成人多见。AAV患儿起病急，进展快，临床表现多样化，停药后疾病易复发[13]。

表1 2022年ACR/EULAR的AAV分类标准

4.1.1 GPA GPA曾被称为韦格纳肉芽肿(Wegener granulomatosis，WG)，儿童发病年龄常见于6.0～16.5岁，女孩多见，常累及上下呼吸道、肾脏和皮肤等脏器。上呼吸道病变多为鼻窦炎、鼻息肉和鼻中隔穿孔等，症状常表现为脓涕、鼻塞、鼻出血和咽痛。儿童GPA的上呼吸道症状尤为突出，部分患者还可伴有听力下降[18]。下呼吸道受累的临床特点主要为咳嗽、呼吸困难、喘息、咯血、肺部结节、肺部浸润灶、肺空洞和胸膜炎。65%～88%的GPA 患者出现肾脏损害，表现为血尿、蛋白尿和肾功能损伤，肾脏病理多提示寡免疫复合物新月体性肾炎。肺部受累较肾脏损害更常见。累及皮肤时，可表现为触痛性皮下结节、皮肤局灶性坏死、紫癜及红斑等[13,19]。

在GPA分类标准的发展历程中，ANCA 的诊断价值逐步得到了重视。2006年，EULAR/欧洲儿童风湿病协会(PRreS)提出儿童血管炎分类标准，将PR3或c-ANCA 阳性列为GPA 的诊断条目[20]。2008 年EULAR-PReS国际儿童风湿病学试验组织(PRINTO)在Ankara 会议上制定的儿童GPA 分类标准，也提及了ANCA 在疾病诊断中的价值[21]。2022 年ACR/EULAR 制定的AAV 分类标准(表1)同样将ANCA作为重要的分类标准依据。研究表明，80%～90%的GPA患者出现ANCA阳性，多为PR3异常升高或c-ANCA阳性(65%～75%)，MPO升高或p-ANCA阳性率为20%～30%[1,22]。此外，ANCA的滴度与AAV的病情活动呈正相关，然而，ANCA阴性亦不能排除AAV[16]。因此，诊断GPA时，要结合临床症状、体征、实验室检查及影像学检查进行综合判断。

4.1.2 EGPA EGPA 曾被称为Churg -Strauss 综合征(CSS)，组织器官中存在嗜酸性粒细胞浸润和坏死性肉芽肿炎症，主要累及中小血管。在儿童极为罕见，在儿童原发性血管炎中约占2%，可累及呼吸系统、肾脏、皮肤、消化道，心脏和神经系统等多个脏器，伴有外周血嗜酸性粒细胞升高。呼吸系统损伤常表现为哮喘、过敏性鼻炎、鼻息肉等。皮肤损伤包括皮疹、皮下结节和网状青斑(40%～52%)等。ANCA 阳性率较低，仅为30%～40%，多为MPO 升高或p-ANCA阳性[1,23]。因此，2022年ACR/EULAR提出了EGPA的新分类标准，ANCA在分类标准中，仅将c-ANCA 阳性列为减分标准，以便与其他类型AAV 进行区分。此外，有研究发现，ANCA 阳性的EGPA患者更易出现皮肤和神经系统损害[24]。ANCA阴性者则易出现心脏损伤[25]。

4.1.3 MPA MPA是一种主要累及小血管的坏死性血管炎，不存在肉芽肿性炎症，寡或无免疫复合物沉积。肾脏是常受累及的器官(75%～100%)，可表现为肾功能异常、血尿和/或蛋白尿，病理特点表现为新月体性肾炎、寡免疫复合物沉积和纤维素样坏死性血管炎。上呼吸道病变罕见，下呼吸道病变可表现为肺出血，该类患儿可出现紫癜样皮疹，易被误诊为紫癜性肾炎。因此，开展ANCA 等生物学标记物检查对MPA 的诊断至关重要[13,26]。在MPA患者中，ANCA 阳性率为65%～90%，多为MPO 升高或p-ANCA阳性(65%～75%)，c-ANCA阳性率为20%～30%[1,6]。从表1可知，2022年ACR/EULAR的MPA分类标准已将ANCA阳性作为一项重要的诊断标准。此外，有研究表明，ANCA阴性的MPA患儿肾功能损伤更严重[27]。因此，ANCA 不仅是分类标准的重要项目，检测该指标还有助于指导疾病预后。

4.1.4 药物诱导的AAV 临床少数药物可诱导AAV，如丙硫氧嘧啶、肼屈嗪和左旋咪唑[28-30]。丙硫氧嘧啶导致的AAV，主要表现为急性肾损伤、上下呼吸道症状、皮炎及粒细胞减少症等，多为a-ANCA阳性，少数为p-ANCA，主要的靶抗原为MPO，少见的靶抗原则包括ELA、LF和BPI等。类似地，肼屈嗪和左旋咪唑导致的AAV，也可出现皮疹、关节痛等多系统受累征象，ANCA检查结果提示a-ANCA阳性为主，偶尔出现p-ANCA或c-ANCA阳性。此外，米诺环素、别嘌呤醇、柳氮磺吡啶、青霉胺和金制剂等药物也可诱发AAV[1]。总体而言，药物诱导的AAV 症状轻重不一，大部分临床症状轻微，或轻度的坏死性血管炎，严重的急进性肾小球肾炎少见。ANCA检测对于药物诱导的AAV具有较好的诊断价值。

4.2 ANCA阳性的其他儿科疾病

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种非特异性慢性胃肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，诊断主要依赖于临床症状、胃肠镜及病理检查结果。在IBD患儿中，p-ANCA阳性占比较高，但其并不是诊断标记物，也与疾病活动无关。如果c-ANCA或PR3阳性，则有助于溃疡性结肠炎的诊断[31]。然而，IBD患者出现ANCA的原因及其应用价值有待于进一步研究与探讨。囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者亦可出现针对靶抗原BPI的ANCA，且与疾病的严重程度相关[32]。此外，原发性硬化性胆管炎患者亦可伴有p-ANCA阳性[33]。由上可知，除AAV之外，其他儿科疾病也可出现ANCA，但其诊断价值有待于进一步研究。

5 结语

ANCA是一类以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。ANCA 检测技术主要包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫法和多重微珠流式免疫荧光法等。AAV是一种主要累及小血管的的坏死性血管炎，寡或无免疫复合物沉积，儿童发病率低，但起病急，进展快，临床表现多样化，停药后疾病易复发。ANCA 检测有助于AAV的早期诊治，从而改善疾病预后。