太赫兹光谱技术快速识别与检测大米中沙蚕毒素类农药残留

张 瑛，吴静珠，刘慧琳*

（1 北京工商大学食品与健康学院 北京 100048 2 北京工商大学计算机与信息工程学院 食品安全大数据技术北京市重点实验室 北京 100048）

当前饥饿问题和粮食供应仍是全世界面临的问题之一。为了提高并保障农业生产力，农药被广泛地施用于农业种植，极大地促进了农业生产，然而，由此也引发了众多与环境和食品相关的问题[1]。沙蚕毒素类农药具有低毒性和高杀虫活性的特点，作为一种广谱杀虫剂迅速推广应用于多种作物的害虫防治[2]，然而，过度及错误使用导致的农药残留所带来的食品安全问题已引起越来越多的关注[3]。我国对沙蚕毒素类农药在食品中的最大残留量 （Maximum residue limits，MRLs） 做了限定，如杀螟丹和杀虫单在谷物、蔬菜、水果和糖料中的MRLs 分别为0.1，3，3，0.1 mg/kg 和0.5，2，1，0.1 mg/kg[4]。欧盟规定茶叶中杀螟丹MRLs 为0.1 mg/kg[5]。建立对沙蚕毒素类农药残留快速、准确、便捷的检测方法对保障食品安全具有重要的意义。目前沙蚕毒素类农药残留检测的方法有大型仪器分析，如高效液相色谱[6]、液-质谱联用[7-8]和气-质谱联用[9-10]等，因其高灵敏度、高精确性和可批量检测而广泛用于食品农残监测过程中的定量分析，然而，其检测技术成本高，需依托大型仪器和复杂的样品前处理，涉及对仪器的定期维护，技术人员的熟练操作，对有机溶剂的需求大以及检测周期较长。新兴的分析法，如光谱分析[11-12]、电化学分析[13]等应运而生，实现了新旧技术的优势互补，有效完善了食品安全领域中对农残的分析方法。

太赫兹（Terahertz，THz）波是位于0.1～10 THz之间的电磁波，含有丰富的分子间作用力，包括氢键作用以及范德华力等在内的振动吸收（分子内和分子间）[14-15]，具有穿透性强、光子能量低、散射程度低以及指纹性的特点[16-18]，能够克服红外光谱和拉曼光谱只对振幅敏感、散射信号弱、易受荧光干扰等不足，因而THz 光谱技术在分析领域具有显著的优势。作为光谱分析的重要分支，太赫兹时域光谱（Terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）技术结合简单成熟的压片预处理，作为新兴的快速检测手段而出现，对许多分子内或分子间振动吸收位于THz 波段的物质实现了快速检测，包括爆炸物[19]、氨基酸[20]、单糖[21]、添加剂[22-23]、农药[24]、抗生素[25-26]等。目前国内外已有研究报道了利用THz 光谱对农残进行检测。Qu 等[27]采用透射式THz-TDS 系统对2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）在茭白、大米和玉米3 种食品基质中0.1～4 THz 范围的吸收特性进行研究，利用1.35 THz 处特征峰对2，4-D 进行定性与定量分析，通过基线校正其检出限降至1%。Cao 等[24]在0.2～1.4 THz 内建立了对面粉中吡虫啉和多菌灵添加量为0～50%的检测模型，通过多元光谱基线校正减少散射，提高THz 光谱信噪比。Qin 等[28]利用透射式THz-TDS 技术结合基于密度快速聚类分析，对番茄粉中多菌灵添加量为0～70%进行判别分析。由于不同结构及振动模式的农药分子在不同THz 波段有特征吸收，因此为应用THz-TDS 技术鉴别和检测农药提供了理论基础。

本文以大米为基质，采用透射式THz-TDS 技术，利用主成分判别分析对经压片处理的3 种沙蚕毒素类农药（杀螟丹、杀虫磺和杀虫单）在0.1～4 THz 范围进行快速识别与检测，旨在为农产品、食品中该类农药残留的安全监测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

聚乙烯粉（Polyethylene，PE），英国剑桥TeraView 公司；杀螟丹（纯度99.0%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；杀虫单（纯度99.8%），中国计量科学研究院；杀虫磺（纯度98.1%），德国Dr.Ehrenstorfer 公司；大米，购于北京当地超市。

1.2 仪器与设备

TeraPulse Lx 太赫兹脉冲光谱仪，英国剑桥TeraView 公司；ME104 精密天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DZF-6012 型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；MX-F 型涡旋振荡器，大龙兴创实验仪器有限公司；PC-15 型压片机，天津品创科技发展有限公司；可脱模压片模具（直径13 mm），天津品创科技发展有限公司；YB-800B多功能粉碎机，永康市速峰工贸有限公司；玛瑙研钵，上海力辰仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备 为了减少样品颗粒直径大于太赫兹波长时产生的散射影响，将采购的大米充分研磨后过150 目筛网以保证样品颗粒直径低于100 μm，于60 ℃下真空干燥24 h 除去水分以减少水分对太赫兹波长的吸收，并置于干燥器中保存备用。综合考虑试验材料杀螟丹、杀虫单和杀虫磺的理化特性（表1），将其置于40 ℃下真空干燥4 h 除去水分并研磨过筛（150 目）。于10 mL 离心管中称取一定量的基质样品 （PE 粉或者大米粉）并添加不同量农药标品，涡旋振荡2 min 使二者均匀混合，配置质量分数为0.002%～16.667%的96 份样品，每个质量浓度做3 个压片重复。准确称取150 mg 混合物置于可脱模压片模具中，于16 MPa 压力下保持90 s 制备得到质地均匀、两面光滑且平行、厚度为1 mm 的压片样品 （直径13 mm）。

表1 3 种沙蚕毒素类农药的结构和性质Table 1 The structure and property of three nereistoxin-related pesticides

1.3.2 太赫兹光谱采集 采用太赫兹脉冲光谱仪配备的透射模块完成光谱采集，透射式THz-TDS系统具有信号响应最大的优点，能够最大化实现对沙蚕毒素类农药的识别与检测。透射式THz-TDS 系统的工作原理如图1所示，太赫兹光源为单台超短飞秒光纤激光器，光电导天线式探测器采样。飞秒激光脉冲经分束器分成泵浦光和探测光，泵浦光激发太赫兹光源（砷化镓）后，THz 脉冲经离轴抛物面镜聚焦，垂直入射压片样品，透过压片样品后与探测波共同被探测器接收，得到了携有压片样品信息的THz 脉冲电场的大小及变化信号并将经锁相放大器放大。光谱分辨率0.953 cm-1，信噪比高达95 dB，信号延迟35 ps，测试波长为0.1～4 THz。

图1 透射式THz-TDS 工作原理简图Fig.1 A schematic diagram of the THz-TDS setup with transmission mode

太赫兹光谱测试环境的温度和湿度对结果具有非常大的影响，将室内温度维持在23.5 ℃以减少温度对结果产生的影响，并且通过向腔室内持续鼓吹高纯氮气以减少环境中水分对太赫兹波的吸收。在氮气持续吹扫的条件下，以氮气环境为参考获取参考信号后相同条件下放入压片样品获取样品信号。光谱采集过程中全程要求佩戴手套，避免直接接触导致压片样品受潮。压片样本放置时要保证与太赫兹入射波方向的垂直。此外，在更换压片样本后需高纯氮气充分鼓吹，从软件界面观察实时谱线以确保腔室内环境与获取参考样品时保持一致。

1.3.3 数据分析方法 THz-TDS 首先获取参考与压片样品的时域光谱信号，利用TeraView 公司自带数据处理软件，经过快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform，FFT）后得到频域光谱信号，根据频域光谱中幅值和相位信息提取所需的光学常数，利用光学常数对含有沙蚕毒类农药压片样品的特性进行研究[29]。选择切趾函数模型Happ Genzel 处理数据，以减少时域光谱头尾不连续造成信号截断引起的误差[30]，经软件处理直接得到压片样品的吸光度和折射率。每一压片样品THz光谱获取时取300 次测量平均为单点值以减少仪器测量误差，并做3 次重复测量后取其平均值。采用Origin 软件绘制THz 光谱并对质量分数与吸光度值做线性拟合分析。将THz 吸收谱图原始数据导入R 语言后，采用经典数据降维的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA） 在95%置信区间对所得THz 光谱进行判别分析，判断不同类别样品的置信区间是否有重叠。

2 结果与分析

2.1 大米粉与沙蚕毒素类农药的THz-TDS

在室温高纯氮气环境下，以对THz 波吸收低、干扰小的PE 为基质，对大米粉、杀螟丹、杀虫磺和杀虫单进行THz-TDS 系统测试，结果如图2所示。图2a 为参考信号和样品信号的时域图，可以看到由于对THz 波有不同程度的吸收、折射和反射，和参考信号相比，4 种样品的时域信号发生不同程度的衰减和延迟，幅值也有所降低。经FFT 得到频域光谱后提取光学常数，得到了4 种样品的THz 折射率谱（图2b）和吸收谱（图2c）。

分析图2b 可知，大米粉、杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的平均折射率分别为1.58，1.63，1.61，1.61，整体上来看4 种不同的样本的平均折射率差别很小，且在THz 波段内变化趋势基本一致，随频率的增大略降低。图2c 中，大米粉在0.1～4 THz 范围呈现出高吸收的斜率背景，但是在整个波段中无明显的特征吸收峰，与Chen 等[31]报道结果一致。杀螟丹在该频段内有3 个特征吸收峰，分别位于0.95，1.96，3.11 THz。杀虫单在该频段内有4 个特征吸收峰，分别位于1.36，1.70，2.60，3.19 THz。杀虫磺在该频段内有3 个特征吸收峰，分别位于1.19，2.15，2.76 THz。这是由于入射的THz 波与杀螟丹、杀虫磺和杀虫单分子的振动能级或转动能级发生不同程度的共振，3 种沙蚕毒素类农药的THz 特征吸收峰均为首次报道，为其常规性定性分析提供了理论可行性。

图2 大米粉、杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的时域谱图（a）、折射率谱图（b）和吸收谱图（c）Fig.2 The time domain （a），refractive indices （b） and absorption （c） spectra of rice，cartap，bensultap and monosultap

为了进一步探究3 种沙蚕毒素类农药混合后对THz 波的吸收，试验中将杀螟丹、杀虫磺和杀虫单充分混匀后以PE 为基质压片，制备得到质量分数为8.333%杀螟丹/8.333%杀虫磺/8.333%杀虫单的三元混合物压片样品，获取THz 吸收光谱，结果如图3所示。与单一农药THz 吸收谱图相比，三元混合物的THz 特征吸收峰（红线）呈现整体趋势符合、局部保留差异的特征。在1.0～3.5 THz 范围内，由于杀螟丹和杀虫单均有明显的吸收峰，杀虫磺特征吸收峰强度相对降低，三元混合物的THz 特征吸收峰并不能完全将其一一对应，而是将相邻位置的峰合并，以更频宽的峰呈现出来，对于杀虫磺强度较低的吸收峰则无法完全识别。

图3 杀螟丹、杀虫磺和杀虫单三元混合物的THz 吸收光谱图Fig.3 THz absorbance spectra of the ternary mixtures containing cartap，bensultap and monosultap

2.2 沙蚕毒素类农药定量分析

由图2c 可知，杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的PE压片在0.1～4 THz 范围内吸收谱图均表现出特征指纹峰，可以用于其在THz 波的定量分析。THz-TDS 系统对农药添加量范围为0.002%～16.667%的PE 片（n=3）进行了光谱测试，取平均后结果如图4a 所示，图中横坐标为频率，单位为THz，纵坐标为吸光度值，单位为a.u.。图4a 中，随着杀螟丹、杀虫磺和杀虫单添加量的降低，其吸收谱图中对应的特征吸收峰强度逐渐减弱。当添加量降低至0.002%时，3 种农药的特征吸收峰基本消失，肉眼不可分辨。为了进一步判断不同农药添加量尤其是低添加量的PE 片在THz 波段中的不同吸收行为，将杀螟丹、杀虫磺和杀虫单不同添加量PE 片的吸收光谱进行PCA 分析，结果如图4b 所示。从图4b 中可以看到，杀螟丹、杀虫磺和杀虫单3 种农药不同量添加后，各质量分数间的置信区间完全分离，彼此不重合，表明其对应PE 片对THz 波具有可区别的吸收行为。

综合考虑样品在高频区对噪声更为敏感，受水分干扰更大，会导致信噪比降低以及特征峰强度的因素，分别选取不同添加量杀螟丹、杀虫磺和杀虫单位于1.95，1.19，1.70 THz 处的特征峰吸收值与其对应质量分数作线性回归分析，结果如图4c 所示。在3 种农药添加0.002%～16.667%的范围内，其线性关系分别为y=0.045x+0.030、y=0.022x+0.079 和y=0.040x+0.038，相关系数R2最低为0.9599，表明特定频率下沙蚕毒素类农药的吸收值与质量分数具有良好的线性相关性，进而说明了利用吸收谱图中特征峰对农药定量分析的可行性。

2.3 大米粉中沙蚕毒素类农药残留THz 光谱分析

通过图4结果可知，结合PCA 判别分析，利用THz 吸收谱图中特征峰处吸收值可以实现对以PE 为基质的3 种沙蚕毒素类农药定性及定量分析。为了进一步探究沙蚕毒素类农药与实际样品在THz 波段中对辐射波的吸收行为，以大米粉为基质，分别添加不同量的杀螟丹、杀虫磺和杀虫单，均匀混合后压片，得到了农药添加量范围为0.002%～16.667%的大米基质压片样品，获取THz吸收光谱，结果如图5A（a-c）所示。由图5A（a-c）可知，不同于在对THz 波无吸收的PE 基质中，3种沙蚕毒素类农药与大米粉混合后，其THz 吸收特征峰均发生不同程度的偏移、合并，且由于大米粉对THz 的强吸收（图2c），其斜率背景使得压片样品吸收强度整体增高。杀螟丹/大米粉样品中的THz 特征吸收峰由在PE 基质中的3 处，转变为在0.1～3 THz 波段内无明显特征吸收峰，杀虫磺/大米粉样品表现出与杀螟丹/大米粉样品相似的特征。但可以看到，尽管杀螟丹/大米粉样品和杀虫磺/大米粉样品均无明显特征吸收峰，随着农药添加量的增加，农药/大米粉样品在0.1～3 THz 波段的吸收强度也呈现出递增的趋势，借助PCA 判别分析，从图5B 可以看到，不同添加量杀螟丹/大米粉样品和杀虫磺/大米粉样品的置信区间均无重叠，表明不同量农药添加的压片对THz 波具有可区别程度的吸收。而杀虫单/大米粉样品在0.1～3 THz 波段中仍保留有1.42，1.72 THz 处的特征吸收峰，同样呈现出随杀虫单添加量增加吸收强度增强的趋势，PCA 判别分析可知农药不同添加量的大米粉压片样品对THz 波具有可区别程度的吸收。以上结果表明可以利用THz-TDS 系统实现对大米粉基质中沙蚕毒素类农药的定量分析，但是3 种沙蚕毒素类农药在大米粉基质中都有很强的吸收斜率背景，且特征吸收峰减弱或消失，这是由于大米粉中含有的丰富碳水化合物、蛋白质和少量脂肪也会吸收THz 辐射，并且与PE 作为基质不同，大米粉作为基质时对待测成分和背景都会产生干扰。

图4 PE 中添加不同量杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的吸收谱图（a）、PCA 分析（b）和吸光度与质量分数的线性关系（c）Fig.4 The absorption spectra （a），PCA plots （b） and linear relationships between the absorbance versus quality score （c）of cartap，bensultap and monosultap with different quality score in PE matrix

图5 大米粉中添加不同量杀螟丹（a、d）、杀虫磺（b、e）和杀虫单（c、f）的吸收谱图（A）和PCA 分析（B）Fig.5 The absorption spectra （A） and PCA plots （B） of cartap （a，d），bensultap （b，e）and monosultap （c，f） with different quality score in rice powder matrix

进一步对添加量相同的杀螟丹/大米粉、杀虫磺/大米粉和杀虫单/大米粉进行PCA 判别分析，结果如图6所示。在0.002%的添加量下，杀螟丹/大米粉、杀虫磺/大米粉和杀虫单/大米粉的置信区间完全分开，彼此分离，这表明尽管以实际样品大米粉为基质时，待测农药对THz 波的吸收会受到干扰，导致特征吸收峰减弱或消失，但通过对其在0.1～3 THz 整段波长内吸收光谱的PCA 判别分析，仍然实现了在低添加量的条件下对杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的区分和识别。通过以上结果分析可知，基于THz-TDS 系统对3 种沙蚕毒素类农药获取的吸收谱图借助PCA 判别分析可以实现对其的定性分析和定量分析。

图6 杀螟丹、杀虫磺和杀虫单在大米粉基质中添加0.002%的PCA 分析Fig.6 PCA plots of cartap，bensultap and monosultap with the quality score of 0.002% in the matrix of rice powder

3 结论

利用透射式THz-TDS 技术结合压片预处理对3 种沙蚕毒素类农药（杀螟丹、杀虫磺和杀虫单） 及其在大米粉基质中的残留进行了快速识别与检测。获取时域信号和频域信号后，对经切趾函数处理后得到折射率谱图和吸光度谱图进行分析，结果表明杀螟丹、杀虫磺和杀虫单在THz 波段吸收谱图中存在特征吸收峰，为农药物质识别提供了依据，借助PCA 判别分析，实现了对杀螟丹、杀虫磺和杀虫单及其与大米粉混合物的定性和定量分析。随待测农药添加量的增加，杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的吸光度呈逐渐增加的趋势，且PCA判别分析对不同添加量的吸收谱图可完全区分。与杀螟丹、杀虫磺和杀虫单不同，大米粉在整个THz 波段中无明显的特征吸收峰，呈现出高吸收的斜率背景。向大米粉基质中分别添加不同量的杀螟丹、杀虫磺和杀虫单，大米粉中复杂的基质效应对3 种沙蚕毒素类农药的检测识别过程产生干扰，使得3 种农药的特征吸收峰减弱或消失，借助PCA 判别分析实现了大米粉基质中0.002%添加杀螟丹、杀虫磺和杀虫单的识别与区分。以上结果表明透射式THz-TDS 技术能够实现对沙蚕毒素类农药残留及在农产品中的快速区分和识别，为THz-TDS 技术应用于农产品中农药残留快速检测提供了理论基础和试验依据。