牛至油对断奶仔猪小肠形态、细胞因子含量及紧密连接蛋白mRNA表达的影响

曾 丽，蔡旭滨，闵思明，王小辉，陈凌峰，黄一帆*，马玉芳*

(1.中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350002；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建 福州 350002)

仔猪断奶技术引起环境及饲料等方面的改变，使得仔猪抗病力降低、肠道正常功能受损等，引起腹泻甚至死亡[1-2]。饲用抗生素因其能有效提高断奶仔猪生产性能、抗病能力等作用被大量应用于养猪生产中，但其滥用而造成的细菌耐药性、机体抵抗力降低甚至影响人体健康的问题也十分突出。我国已于2020年7月1日停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料[3]。因此，寻找合适的抗生素替代物是行业内关注的重点。而植物提取物因其有抗菌、杀菌、提高动物免疫力、提高动物生产性能等作用成为替抗热点之一[4-5]。牛至油(oregano essential oil，OEO)是从植物牛至(OriganumvulgareL.)中提取的一种植物精油，已被我国农业部批准作为一种药物饲料添加剂可长期在饲料中添加[6-7]。OEO具有抗氧化、促生长、促进消化吸收、增强免疫力等作用，且绿色环保无污染，可作为饲用抗生素的一种替代物[7-8]。课题组前期研究表明，饲粮中添加OEO能提高血清和小肠组织中胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量，促进断奶仔猪生长[9]。研究表明，IGF-Ⅰ对肠道的发育具有调节作用，并在其发育过程中起重要作用[10]。但是，目前关于OEO对断奶仔猪肠道健康影响的研究却鲜见报道。本试验在断奶仔猪基础饲粮中添加不同添加量的OEO，通过检测试验猪小肠形态、小肠组织细胞因子和分泌型免疫球蛋白(SIgA)含及和肠道紧密连接相关基因表达的变化，从肠道健康方面探讨OEO对断奶仔猪保健的作用机制，为其在断奶仔猪方面的临床应用提供数据借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要试剂牛至油(半包被的10%牛至油预混剂，主要成分为香芹酚和百里香酚各占5%，包被材料为轻质碳酸钙)，购自福建中农牧生物药业有限公司[9]。

1.2 试验动物与分组选取胎次相近、25日龄断奶的“大白×长白”二元杂交仔猪120头，按公母各半、体质量相近的原则随机分为4组，对照组(A组)饲喂基础日粮，3个试验组分别在基础日粮中添加OEO 300(B组),500(C组),800(D组) mg/kg，每组3个重复。预试期为5 d，正试期为30 d。日粮配方参见文献[9]饲养管理与免疫程序按照常规进行。

1.3 测定的指标及方法

1.3.1样品采集 试验结束当天，每个重复随机挑选1头仔猪剖杀，分别取十二指肠、空肠、回肠，取1份样品进行4%多聚甲醛溶液固定，用于肠道形态结构的测定。另取1份样品装入冻存管中，-80℃保存，用于肠道细胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)和SIgA及仔猪肠道紧密连接相关基因表达的测定。

1.3.2小肠组织样品处理 具体操作见参考文献[11],运用ImageProPlus6.0软件计算肠绒毛长度和隐窝深度，并计算绒毛长度与隐窝深度比值(V/C)。

1.3.3肠细胞因子和SIgA含量测定 ELISA测定肠道组织黏膜中IL-2、IL-6、IFN-γ的含量及不同肠段组织中SIgA含量，具体操作见试剂盒说明书，测试仪器为全自动酶标仪(STATFAX2100，Awareness Technology Inc.USA)。

1.3.4仔猪肠道紧密连接相关基因表达的测定 采用荧光定量PCR检测仔猪十二指肠、空肠、回肠黏膜的闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(Occludin)和跨膜蛋白(Claudin)的mRNA相对表达量。具体操作及引物序列按照参考文献[11]进行。相对表达量用2-△△Ct方法计算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)试验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。引物序列见表1。

表1 基因的扩增引物序列

2 结果

2.1 OEO对断奶仔猪肠道形态结构的影响试验仔猪肠道形态结构见表2。由表2可知，各试验组仔猪肠道绒毛长度均有一定程度提高,十二指肠和空肠中C组与A组差异显著(P<0.05);各试验组隐窝深度均有一定程度下降，十二指肠中C组与A组差异显著(P<0.05)；各试验组绒毛高度与隐窝深度的比值均有一定程度降低，空肠中B组与A组差异显著(P<0.05)，C组与A组差异极显著(P<0.01)，回肠中C组与A组差异显著(P<0.05)。

表2 牛至油对断奶仔猪小肠形态的影响 μm

2.2 OEO对断奶仔猪肠道细胞因子和SIgA的影响由表3可知，各试验组仔猪肠道IL-2、IL-6、IFN-γ及SIgA均有一定程度提高，除回肠IL-2和IL-6以及空肠IFN-γ在3个试验组中与A组相比无显著性差异(P>0.05)外，其余各组与A组相比有显著性差异或极显著性差异(P<0.05或P<0.01))。

表3 牛至油对断奶仔猪肠道组织细胞因子和SIgA含量的影响

2.3 OEO对断奶仔猪小肠紧密连接基因相对表达的影响

2.3.1OEO对断奶仔猪十二指肠紧密连接基因相对表达的影响 从图1可见，与A组相比，试验仔猪十二指肠肠紧密连接基因表达量均有一定程度提高，其中除D组Occludin和Cladudin mRNA表达量显著提高外(P<0.05)，其余各组与A组相比有极显著性差异(P<0.01)。

与A组相比，** P<0.01，*P<0.05。下同

2.3.2OEO对断奶仔猪空肠紧密连接基因相对表达量的影响 从图2可见，与A组相比，试验仔猪空肠紧密连接基因表达量均有一定程度提高，其中C组紧密连接蛋白ZO-1表达量有极显著提高(P<0.01)，B、C组Occludin和Cladudin mRNA表达量有极显著提高(P<0.01)，而D组有显著提高(P<0.05)。

图2 OEO对断奶仔猪空肠紧密连接基因相对表达量的影响

2.3.3OEO对断奶仔猪回肠紧密连接基因相对表达量的影响 从图3可见，与A组相比，试验仔猪回肠紧密连接基因表达量均有一定程度提高，其中紧密连接蛋白ZO-1表达量在C组极显著提高(P<0.01)，而B、D组显著提高(P<0.05)，Occludin mRNA表达量在B、C、D组极显著提高(P<0.01)，Cladudin mRNA表达量在B、C、D组显著提高(P<0.05)。

图3 OEO对断奶仔猪回肠紧密连接基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 OEO对断奶仔猪小肠形态结构的影响断奶仔猪小肠黏膜形态结构的完整性是仔猪肠道吸收功能和机体生长发育的基础，而绒毛高度、隐窝深度及V/C值是反映小肠黏膜形态结构的重要指标[12]。研究表明，仔猪早期断奶会引起小肠绒毛长度[13]、形状[14]、隐窝深度[15]等指标变化。肠绒毛能扩大肠内吸收营养物质的面积，较高的V/C值更有利于吸收营养物质，而肠绒毛萎缩、隐窝变深则会降低营养物质的吸收率[15-16]。日粮中添加百里香酚或香芹酚和百里香酚混合物可增强断奶仔猪肠道屏障功能，减少断奶应激，改善肠道健康[17-18]。MICHIELS等[19]研究发现，日粮中添加香芹酚和百里酚可提高小肠远端V/C值。宋转等[12]研究发现，在日粮中添加复合植物精油(含牛至油、百里香油等)能够增加断乳仔猪空肠和回肠的肠绒毛长度，提高V/C值，缓解肠道损伤。本试验结果表明，饲粮中添加不同质量浓度OEO可以不同程度地提高十二指肠、空肠和回肠的肠绒毛长度，降低隐窝深度，提高V/C值，且在饲粮中添加500 mg/kg OEO对提高小肠V/C值效果最好，这也与本课题组前期研究结果一致[9]：日粮中添加OEO后，断奶仔猪平均日采食量、平均日增重提高，腹泻率降低，且相关血清激素指标及小肠组织中的IGF-Ⅰ含量升高，说明OEO同上述植物提取物一样能够促进肠道发育，改善小肠黏膜形态结构，增强小肠的吸收功能，促进断奶仔猪生长。

3.2 OEO对断奶仔猪肠道细胞因子、SIgA含量的影响肠黏膜免疫屏障能主要依靠肠道相关淋巴组织、SIgA和细胞因子等其他免疫活性物质发挥其免疫功能。SIgA具有防止病原微生物在肠道附着、激活补体及溶解细菌等作用，而细胞因子对肠黏膜免疫屏障作用进行调节[13]。IL-2能够激活和促进T细胞增殖分化，具有免疫激活、免疫耐受及双向调节作用[19]。IL-6可促进T淋巴细胞表面表达IL-2受体，增强IL-2作用等功能，从而改善机体免疫功能[20]。因此，肠黏膜白介素能够促进T、B淋巴细胞增殖分化，产生特异性抗体，提高SIgA肠道黏膜免疫功能[21]，而IFN-γ能够通过促进IL-2生成，进而发挥其黏膜免疫的功能。OEO中的百里香酚和香芹酚可增强肠道屏障功能，减少病原微生物对肠道上皮细胞的损伤[22]。XUN等[23]研究发现，在仔猪日粮中添加300或400 mg/kg姜黄素21 d后SIgA的含量增加；白藜芦醇可通过提高IFN-γ水平和降低TNF-α水平进而调节仔猪的体液免疫应答[24]。本试验结果表明，添加OEO能不同程度地提高断奶仔猪肠道黏膜IL-2、IL-6以及IFN-γ和SIgA含量，这可能与OEO有效成分能激活效应T细胞产生细胞因子IL-2、IL-6等有关，这些细胞因子能促进B细胞增殖，进一步分化为浆细胞，从而促进SIgA的合成，加强肠道的免疫功能。

3.3 OEO对断奶仔猪紧密连接基因相对表达量影响肠道黏膜屏障发挥正常功能主要依赖于肠上皮细胞间紧密连接的状况，其中紧密连接蛋白Occludin、Claudins和ZO-1等是形成其结构与组成的基础[25-26]。ZO-1和Occludin的表达量与肠道屏障的正常功能密切相关，前者影响肠道屏障的通透性，后者则影响肠黏膜机械屏障的稳定性，而Claudins的磷酸化程度则反映与肠上皮紧密连接的结构和功能状态，其磷酸化失调将导致胃肠屏障功能受损，黏膜通透性增强[25,27]。研究表明，仔猪断奶后，肠上皮紧密连接蛋白表达量下降(包括Occludin、ZO-1 mRNA丰度以及ZO-1的表达量降低)，肠黏膜通透性增加[28],姜黄素可通过上调 Occludin 和ZO-1 表达来改善紧密连接和肠黏膜屏障功能受损程度，促进肠上皮细胞间紧密连接，降低肠黏膜通透性，进而增强其机械屏障功能[29]。而本试验结果显示在饲粮中添加不同浓度OEO可以不同程度地提高回肠、空肠和十二指肠连接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin表达，其中C组效果最好，表明OEO能通过提高紧密连接基因表达量，增强肠黏膜机械屏障功能，但其有效成分如何影响紧密连接蛋白的结构、功能甚至基因表达的机制仍需进一步研究。