荧光定量PCR法和免疫胶体金法对沙眼衣原体的检测效果对比分析

刘小琳，杨 浩，任天凤 (信宜市妇幼保健院，广东 信宜 525300)

沙眼衣原体(CT)为性传播疾病的主要病原体，目前我国CT感染呈现逐年上升的趋势，其根本原因是CT感染后抗生素使用不合理所导致的，前列腺炎、附睾炎、尿道炎是男性CT感染后的主要症状，而子宫内膜炎、宫颈炎、盆腔炎是女性CT感染后的主要症状，部分患者还会出现肛周炎、异位妊娠、不孕症等并发症，对患者的生活质量造成严重的影响[1]，因此，及早、快速、准确地诊断CT感染对于其治疗和改善预后具有积极意义。传统的病原微生物检测方法有涂片、培养、免疫学等技术，其检出效果差，需要的时间长，增加了临床诊断的难度[2]。近年来，随着检验技术的不断发展，胶体金标法和荧光定量PCR法已成为临床上广泛用于检测CT感染的方法，但其灵敏度和特异度各不相同[3-4]，本文旨在对比分析荧光定量PCR法和免疫胶体金技术对信宜地区沙眼衣原体的检测效果，为今后临床选择合适的方法检测CT感染提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2019年1月～2020年5月信宜地区180例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象，纳入标准：信宜地区户籍或在信宜地区常住3年以上的人群，签署知情同意书，自愿参与本研究。排除标准：严重肝肾功能异常，心脑血管异常，精神障碍，心理障碍，传染病史，凝血功能障碍患者。其中男67例，女113例，年龄21～32岁，平均(28.34±5.21)岁，细菌学培养结果显示：阳性170例，阴性10例。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2标本采集：设备：上海宏石提供的 SLAN-96S 荧光定量 PCR仪。

样本采集：男性：对尿道局部皮肤全面消毒，反转包皮，使用专用的拭子采集标本，若取样尿液则首先清洗包皮后留取样本；女性：局部皮肤全面消毒，将棉拭子插入患者尿道约2 cm深度，若是外阴病灶则使用棉拭子提取周围分泌物，阴道分泌物也采用相同的方法留取。每位患者留取3份样本，分别用于细菌培养、荧光定量PCR检测、免疫胶体金标法检测。

检测试剂：沙眼衣原体抗原检测试剂[生产厂家：艾康生物技术(杭州)有限公司，批准文号：国食药监械(准)字2010第3400386号]，沙眼衣原体核酸检测试剂(生产厂家：广州凯普医药科技有限公司，批准文号：国械注准20143401937)。

荧光定量PCR法：EP管中加入无菌生理盐水1 ml并摇匀，伸入采集管底部吸取临床样本0.8 ml加入1.5 ml离心管中；13 000 r/min离心90 s，弃上清(可保留残液约20 μl)。加入0.5 ml细胞保存液振荡重悬细胞，13 000 r/min离心90 s，尽量去尽全部上清。每样本加入50 μl细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10 min。13 000 r/min离心10 min，取上清(上清为释放的DNA)2 μl作为PCR扩增模板，加入反应试管(含PCR反应液)中，设定阴性对照和阳性对照各一管，设定PCR反应体系，扩增结束分析软件自动分析，阳性：CT值>37。

胶体金法：根据沙眼衣原体抗原检测试剂[生产厂家：艾康生物技术(杭州)有限公司，批准文号：国食药监械(准)字2010第3400386号]说明书实施检测，裂解样本获取沙眼衣原体抗原，将裂解后含有抗原的溶液滴入加样孔内，20 min后读取结果，阳性：测试区和质控区均出现紫红色条带。

培养法：以细菌培养结果作为金标准，培养方法如下：采用McCoy 细胞作为宿主细胞，从-80℃的冰箱中取出标本，并将其放置在37℃水浴箱中，取0.2 ml接种在McCoy 细胞上，离心60 min后取出放置在培养箱(37℃、5%CO2)中2 h将上清液去除，重新加入1 ml衣原体生长培养基并放置在培养箱(37℃、5%CO2)中培养48 h，将培养板取出，烘干后加入甲醇固定15 min，碘染色后将其倒置在显微镜下观察McCoy 细胞胞浆内形成的衣原体包涵体，阳性：≥2个包涵体/孔。

1.3观察指标：以细菌学培养结果作为金标准，计算荧光定量PCR法、胶体金标法检测沙眼支原体的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度及Kappa值，并进行比较。

1.4统计学方法：采用SPSS22.0统计学软件进行t检验与χ2检验。

2 结果

以细菌培养结果作为金标准，荧光定量PCR法诊断CT感染的灵敏度、阴性预测值、准确度、Kappa值显著高于免疫胶体金法，两组差异有统计学意义(P<0.05)；两种方法检测CT感染特异度、阳性预测值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 两种方法检测沙眼衣原体效果比较(%)

表2 两种方法检测沙眼衣原体效果比较[n(%),n=180]

3 讨论

近年来沙眼衣原体(CT)感染的患者逐年上升，受到全球的广泛重视，截至2020年全球新发感染CT患者达到3亿，生殖道沙眼衣原体感染逐渐升高[5]。无症状CT感染患者中男性与女性比例为3∶7，若不能及时诊断和治疗极易发生逆行感染，男性出现前列腺炎、附睾炎、不育症，而女性极易发生输卵管炎、盆腔炎，妊娠期妇女容易流产、死胎，因此，对于CT感染应及早诊断并给予有效的治疗[6]。沙眼衣原体是临床上常见的泌尿生殖道感染的病原体，免疫胶体金法、涂片法、细菌培养法是目前临床上常用的检测方法，其中细菌培养法是临床上公认的检测CT感染的金标准，但是该方法时间长，而常用的方法敏感性差、可靠性差也不能为临床上治疗提供重要的依据，限制了其在临床上应用[7]。

荧光定量PCR法可对目的基因进行扩增，杂交特异分子，其结合了化学荧光发光法，在封闭的环境中进行，可通过计算机的调控实现动态和自动化检测，提高检测的灵敏度及准确度，还能缩短检测的时间[8]，随着荧光定量PCR技术的不断发展，其被广泛应用在基因检测中，并且在增加基因产物后该方法的荧光信号强度增强，因此，每次循环后需要进行一次荧光信号的收集，从而获取荧光扩增曲线，进而提高检测的准确度[9]。本研究显示，荧光定量PCR法检测CT感染的灵敏度、阴性预测值、准确度、Kappa值显著高于胶体金标法，说明荧光定量PCR法检测CT感染的准确性更高，当标本中衣原体抗原含量较低的情况下，此时采用免疫胶体金技术检测可能会呈现假阴性，灵敏度较低，而荧光定量PCR法检测的效果则不受抗原含量的影响，样品中即使存在极低含量的病原体基因，荧光定量PCR法也可以通过扩增检测到。免疫胶体金技术检测CT感染反映的是机体对于CT的免疫反应状态，不能判定是既往感染还是当前感染，而荧光定量PCR法则能够真实的反映CT的存在和目前的繁殖程度，可有效判断目前CT是既往感染还是现症感染，为临床治疗方案的制订提供依据[10]。荧光定量PCR法和免疫胶体金技术对于CT感染的检测各自存在优缺点，但是荧光定量PCR技术操作时间短及检测时间更短，灵敏度、准确度更高，并且荧光定量PCR法可对病原体进行定量检测，不但能够提高诊断的价值，还可用于流行病学的监测与调查[11]。

综上所述，与免疫胶体金法相比，荧光定量PCR法检测CT感染的效果更优，不但缩短时间，便于操作，还可提高检测的灵敏度、准确度，为临床诊治提供有效依据。