慢性牙周炎患者唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p的表达与诊断价值研究

杨贞忞,袁通穗 (.贵阳市口腔医院口腔颌面外科,贵州 贵阳 55000;贵阳市口腔医院牙周科，贵州 贵阳 55000)

慢性牙周炎是指发生在牙龈、牙骨质等牙齿支持组织的疾病[1]，其病理过程主要是由牙菌斑形成的龈上牙石或龈下牙石对牙周组织产生的渐进并持续的炎性破坏[2]。有研究指出，在我国牙周炎是成人失牙的主要原因，并且患病率高于龋病，这极大降低了患者的生活质量并增加了社会经济负担[3]。由于目前临床上缺乏有效的治疗手段，临床上更加重视如何预防慢性牙周炎的发生及其发展[4]。但慢性牙周炎的诊断方法敏感率较低，故有大量研究通过对慢性牙周炎患者龈沟液中的一些炎症因子或者相关基因进行检测，以期提高该病诊断阳性率和判断其严重程度[5-6]。而龈沟液存在不易采集以及容易受到污染等因素，而导致该方法存在一定局限性，单链非编码微小RNA(miRNA)已经在大量研究中证实在诊断、预测疾病的预后具有一定的优势[7-8]。本研究前期通过生物信息学方法，在GEO数据库中挖掘在慢性牙周炎患者的唾液中表达明显增高的miR-22-3p和miR-378a-3p，后期通过实验验证，拟为慢性牙周炎患者的早期诊断提供一定依据。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2019年1月～2021年6月于贵阳市口腔医院牙周科就诊的患者90例，其中牙周组织健康者22例为对照组，慢性牙周炎68例为观察组。纳入标准：①年龄≥18周岁；②除第三磨牙外余留牙≥20颗，其中有4颗磨牙；③无糖尿病等系统性疾病；④无正畸治疗史；⑤6个月内未接受牙周治疗；⑥女性未妊娠，未服避孕药，且不在哺乳期、月经期。本研究经贵阳市口腔医院伦理委员会审查批准，所有患者均签署知情同意书。对照组中男13例，女8例；年龄18～50岁，平均32岁。观察组又分为轻度慢性牙周炎组(23例，男13例，女10例；年龄18～52岁，平均35岁)、中度慢性牙周炎组(22例，男8例，女14例；年龄33～55岁，平均41岁)、重度慢性牙周炎组(23例，男13例，女10例；年龄39～60岁，平均49岁)。

1.2方法

1.2.1标本采集：观察组所有患者在治疗前进行唾液收集，对照组在体检时进行唾液收集，在研究对象晨起后用表面有2%枸橼酸的棉签擦拭口腔，收集唾液约1 ml，在4℃离心机中3 000 r/min离心15 min，取上清液放置在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2检测方法：唾液miR-22-3p、miR-378a-3p的含量均采用实时荧光定量 PCR(RT-PCR)进行检测，试剂盒购自上海百蕊生物科技有限公司，RT-PCR测量仪购自德国Qiagen公司，小型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。首先，提取唾液中总RNA，采用去除基因组反转录试剂盒，将待测标本反转录为cDNA，采用 RT-PCR进行检测。本研究结果均采用2-ΔΔCt法换算miRNA的相对表达量。

2 结果

2.1观察组和对照组miR-22-3p、miR-378a-3p水平比较:观察组唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p含量水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比较

2.2观察组各亚组miR-22-3p、miR-378a-3p水平比较：重度慢性牙周炎组患者的唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于轻度和中度慢性牙周炎组，中度慢性牙周炎组miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于轻度慢性牙周炎组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比较

2.3观察组miR-22-3p、miR-378a-3p含量相关性：相关性分析结果显示，慢性牙周炎患者中，miR-22-3p与 miR-378a-3p水平呈正相关(r=0.467，P=0.019)。

2.4ROC曲线分析:采用ROC曲线评价血清 miR-22-3p与 miR-378a-3p及两者联合对慢性牙周炎的诊断价值，结果显示miR-22-3p与 miR-378a-3p联合曲线价值要优于两者单独诊断价值。见表3、图1。

表3 miR-22-3p、miR-378a-3p及两者联合检测 ROC曲线下面积

图1 miR-22-3p、miR-378a-3p及两者联合检测对慢性牙周炎诊断的 ROC曲线

3 讨论

慢性牙周炎的病理生理特征为患者牙周组织存在持续的慢性炎症反应，这不仅损害牙齿支持组织，部分病情严重的会导致牙齿脱落[9]。有研究甚至指出，随着炎性介质和龈下的细菌在口腔中扩散，使得患者罹患部分癌症的风险也随之急剧增高[10]。因此，临床上亟需通过敏感指标对于慢性牙周炎进行早期诊断和对其病情严重程度进行早期预测，从而通过尽早干预，以期提高慢性牙周炎的治疗效果和预后。目前临床上已有不少相关研究证实，患者外周血清或龈沟液中的白细胞介素同慢性牙周炎的疾病严重程度存在一定关系[11-12]。但目前临床中仍无慢性牙周炎的特异性唾液标志物。miRNA是一类小分子非编码RNA，其参与肿瘤、心血管疾病、神经系统和炎性疾病等多种疾病的发生发展[13]。国外学者发现大鼠牙周炎模型中外周血中miR-207、miR-495 表达上调[14]，提示miRNA同牙周炎存在一定的关系，miRNA 极有可能成为慢性牙周炎新的诊断标志物，本研究拟通过检测患者唾液中敏感miRNA含量来诊断慢性牙周炎或者判断其严重程度。

miR-22-3p被发现在冠心病动物模型中，通过靶向抑制Notch通路抑制炎性细胞因子的分泌[15]，提示miR-22-3p同炎性反应关系密切。通过对68例慢性牙周炎患者的唾液标本检测，发现miR-22-3p含量较正常健康患者明显升高，而且随着慢性牙周炎病情的加剧其含量进一步增高，说明miR-22-3p同牙周炎中的炎性反应存在一定的关系。有研究发现，miR-378a-3p通过GSK-3β /β-catenin信号通路来调控口腔鳞状细胞癌的增殖和凋亡[16]。本研究结果显示慢性牙周炎患者的唾液中的miR-378a-3p含量升高，且同慢性牙周炎的病情呈正相关。此外，本研究结果还发现miR-22-3p和miR-378a-3p两者含量呈正相关关系。上述结果表明miR-22-3p和miR-378a-3p可能显著增加慢性牙周炎的患病风险，可能通过加剧炎性反应从而加剧慢性牙周炎的发生和发展。ROC曲线结果进一步显示miR-22-3p和miR-378a-3p两者联合对于慢性牙周炎的诊断价值要优于两者分别单独诊断，这为临床上诊断慢性牙周炎以及判断其病情严重程度提供一定的理论基础，但miR-22-3p和miR-378a-3p同慢性牙周炎患者预后的关系以及具体作用机制应进一步研究。