丹参根腐病病原菌的分离、鉴定及防控药剂筛选

李程锦，尚怀国，苏霞，郭文秀，王瀚悦，门兴元，李丽莉，宋莹莹，高龙飞，马国苹，于毅

(1.山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，山东 济南 250100；2.全国农业技术推广服务中心，北京 100125；3.山东省农业技术推广中心，山东 济南 250100)

丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)又名赤参、山参、红参、紫丹参等，入药历史悠久，是唇形科鼠尾草属植物[1]，种植范围分布于辽宁、北京、山东、河南等地[2，3]，是我国传统医学中使用最早和最普遍的中药材之一[4-6]。现代临床医学中它主要应用于治疗心血管疾病、缺血性脑卒中和恶性肿瘤等疾病，还具有养血、安神等功效[7-9]。

根腐病是丹参生产中的一种主要病害，近年来，随着连作和种植结构的改变而普遍发生，危害严重。根腐病主要危害丹参根部，严重影响其产量和品质。发病初期，最先危害丹参的侧根和须根，发病部位呈水渍状，后由红褐色逐渐加深，并迅速扩展到主根，根切后可以看到维管束发生褐色病变，后期根皮呈纤维状，极易拔出，植株地上部枯萎[10-12]。研究发现，根腐病的主要致病菌为镰刀菌[13]。镰刀菌的寄主范围广，能从根部侵染多种植物，发生根腐病，是重要的植物病原菌[14]。

山东省蒙阴县连城镇对山庄村丹参根腐病发生较重，发病率较高，致使丹参产量下降，品质降低。因此，为更加有效地防控丹参根腐病，降低丹参根腐病的发病率，提高收入，本试验对该地区丹参根腐病进行病原菌的分离鉴定、致病性测定和药剂筛选，以期为防治丹参病害提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

于2019年10月在山东省蒙阴县连城镇对山庄村发病严重区域采集具有典型根腐病症状丹参病株。

1.2 病原菌的分离与纯化

将病株洗净晾干，在超净工作台上用手术刀从病健交界处切取约1 cm2的组织块，75%乙醇消毒30 s后，再用1%次氯酸钠溶液消毒10 s、无菌水漂洗3次[15]，最后用灭菌滤纸吸干多余水分，接种于PDA培养基中央，25℃恒温培养箱中倒置培养5 d，待菌丝长出后采用挑取菌丝尖端法进行多次纯化。

1.3 病原菌的形态学鉴定

将分离得到的菌株接种在PDA培养基上，25℃恒温培养箱中倒置培养1～2周，肉眼观察菌丝的生长状况、菌落颜色和质地；显微镜下观察菌丝形态、孢子类型、孢子形状、有无隔膜等，并拍照。根据观察到的病原菌形态特征，参考《植物病原真菌学》[16]对病原菌进行形态学鉴定。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定

将分离菌株接种到PDA培养基上，25℃恒温培养箱中倒置培养5～7 d。刮取200 mg新鲜菌体，用研磨器研磨后按DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，4℃冰箱保存。

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增[17]。PCR扩增体系(25 μL):2×EsTaqPlus Master-Mix(Dye)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序:95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。4℃保存。

PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测定的rDNA-ITS序列在GenBank数据库中进行Blastn比对分析。使用MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定菌株的种类。

1.5 病原菌的致病性测定

菌株在PDA培养基上培养5～7 d，用无菌水配制成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液[18]。室温条件下采用灌根接种法[19]将孢子悬浮液均匀接种在丹参健株根部周围，接种量为10 mL/株[20]，对照组用无菌水浇灌植株。每个处理重复3次，分别在接种第10、20、30 d观察植株发病情况。待接种丹参植株出现根腐病的典型症状后，切取植株发病部位的病健交界处，再次分离病原菌，比较前后两次得到的病原菌是否相同，即按柯赫氏法则完成对病原菌的回接及再分离试验。

1.6 室内药剂筛选

供试药剂:98%吡唑醚菌酯原药、96%嘧菌酯原药、95%丙环唑原药、96.3%苯醚甲环唑原药、2 000亿/克孢子枯草原粉，均购自山东康乔生物科技有限公司。

采用菌丝生长速率法[21]进行丹参根腐病菌对5种供试药剂的敏感性测定。将供试药剂配制成不同浓度梯度的含药培养基，以等体积无菌水为对照，每个处理重复3次。将分离菌株接种到含有不同杀菌剂浓度的PDA平板上，25℃恒温培养箱培养。7 d后测量不同药剂浓度菌落直径，并计算抑制率[22]。

抑制率(%)＝(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100 。

利用DPS 7.05软件进行相关统计分析，以药剂浓度对数作为横坐标，以抑制率转换为几率值作为纵坐标，求相关系数(r)、毒力回归方程，从而计算各种供试药剂对病原菌的抑制中浓度(EC50)[23]。

1.7 盆栽药效试验

供试药剂:40%丙环唑(山东兆丰年生物科技有限公司)、10%苯醚甲环唑(先正达南通作物保护有限公司)。

灌根接种法:将分离菌株在PDA培养基上培养5～7 d，用无菌水配制成孢子悬浮液，浓度约为1×106个/mL。室温条件下将分生孢子悬浮液均匀接种在丹参健株根围，接种量为10 mL/株，定期观察并记录植株的发病情况。配制6个不同浓度梯度的药剂，待丹参植株表现明显症状后，对患病丹参植株进行灌药处理，以无菌水为对照。分别于灌药10、20 d后观察丹参植株的发病情况，并统计丹参植株的病情指数。

丹参根腐病分级标准[24]:0级，无病；1级，根茎有少量病斑；3级，根茎病斑较多，维管束褐色，尚未木质化；5级，病根有部分开始腐烂，腐烂部分占根茎体积30%以下；7级，腐烂部分占根茎体积30%以上，地上部植株萎蔫变黄；9级，根茎腐烂，植株枯死。

病情指数＝∑(各级病级株数×各级级值)/(调查总株数×最高级值)×100 ；

防治效果(%)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100 。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学特征

经分离纯化共得到3种不同形态的菌株，分别命名为形态组Ⅰ、形态组Ⅱ和形态组Ⅲ。形态组Ⅰ菌株气生菌丝为黑色，形态组Ⅲ菌株气生菌丝绒毛状，产浅粉色色素，平均日生长量分别为5.8 mm和5.9 mm，孢子呈椭圆形；形态组Ⅱ菌株气生菌丝为绒毛状，不产色素，平均日生长量为7mm，孢子呈镰刀形(图1)。

图1 病原菌菌落形态

根据观察到的病原菌形态特征，再参考相关文献，初步确定病原菌为镰刀菌属真菌。

2.2 病原菌分子生物学鉴定

丹参根腐病病原菌形态组Ⅰ菌株rDNA-ITS扩增序列约538 bp，形态组Ⅱ菌株约527 bp，形态组Ⅲ菌株约548 bp(图2)。由系统发育树(图3)可知，形态组Ⅰ和形态组Ⅲ菌株与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumstrain WZ-67)亲缘关系最近；形态组Ⅱ菌株与木贼镰刀菌(Fusarium equisetistrain UMAS MS25)亲缘关系最近，结合形态学鉴定结果，确定丹参根腐病病原菌为尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌。

图2 3种形态菌株PCR扩增产物电泳图

图3 基于rDNA-ITS序列采用邻近法构建代表菌株及其相似菌株的系统发育树

2.3 致病性分析

接种分离菌10 d后丹参叶片开始出现变色萎蔫症状，20 d后丹参地上部分根茎逐渐开始变色进而枯黄，30 d后发病严重植株出现明显干枯症状。此时取发病严重丹参植株带回实验室后将根部洗净，发现地下部分出现明显腐烂症状。第30 d发病率分别达81%、75%、84%(表1)，发病植株症状与田间症状相同，且对照组无发病症状。将患病根部进行病原菌分离，得到的病原菌特征与原接种病原菌相同，并且分离纯化后的病原菌80%为形态组Ⅱ菌株，证明木贼镰刀菌是丹参根腐病的主要致病菌。

表1 病原菌的致病性测定

2.4 室内药剂筛选

通过计算抑制率可以判断供试药剂相对毒力大小，抑制率高的药剂相对毒力就大[25]。结果(表2)表明，5种药剂对木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌都有一定的抑制效果，且抑制率与药剂浓度成正比，但不同药剂之间抑制效果存在差异。95%丙环唑对木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌抑制效果较好，浓度为1 100、2 200、4 400 mg/L时对木贼镰刀菌的抑制率分别为81.28%、90.08%、94.85%；275、550、1 100、2 200、4 400 mg/L的95%丙环唑对尖孢镰刀菌的抑制率分别为84.63%、90.07%、96.86%、100%、100%。96.3%苯醚甲环唑对木贼镰刀菌的抑制效果较好，浓度为480、960、1 920、3 840 mg/L时对木贼镰刀菌的抑制率分别为84.04%、85.08%、87.36%、88.07%。2 000亿/克孢子枯草原粉对尖孢镰刀菌的抑制效果较好，浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L时对尖孢镰刀菌的抑制率分别为83.39%、86.81%、89.25%、89.89%、91.20%。96%嘧菌酯和98%吡唑醚菌酯对木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌抑制效果较差。

表2 5种药剂对丹参根腐病病原菌菌丝生长的影响

2.5 5种药剂对丹参根腐病病原菌的室内毒力

98%吡唑醚菌酯、96%嘧菌酯、95%丙环唑、96.3%苯醚甲环唑、2 000亿/克孢子枯草原粉对木贼镰刀菌的EC50分别为474.1955、837.5054、97.0750、17.6659、0.3195 mg/L，对尖孢镰刀菌的EC50分 别 为92.8179、1 820.2780、46.4313、16.0471、0.0520 mg/L(表3)。因此，5种药剂对木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌的毒力均为2 000亿/克孢子枯草原粉＞96.3%苯醚甲环唑＞95%丙环唑＞98%吡唑醚菌酯＞96%嘧菌酯。

表3 丹参根腐病病原菌对5种药剂的敏感性

2.6 盆栽药效试验

盆栽药效试验结果(表4)表明，分别用100、200、300、400、500、600 mg/L的10%苯醚甲环唑处理患病丹参植株，10 d后药剂的防治效果分别为14.65%、31.82%、32.83%、49.75%、63.38%、78.54%，20 d后药剂的防治效果分别为38.11%、49.48%、67.31%、68.88%、78.91%、88.99%。分别用500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的40%丙环唑处理患病丹参植株，10 d后药剂的防治效果分别为22.73%、27.27%、27.27%、36.36%、77.27%、79.55%，20 d后药剂的防治效果分别为44.93%、47.03%、58.04%、74.83%、89.69%、91.96%。由此可知，10%苯醚甲环唑和40%丙环唑对丹参根腐病的防治效果均较好，并且防治效果随药剂浓度的升高而增加。

表4 丹参根腐病盆栽药效试验结果

3 讨论与结论

镰刀菌属是目前为止发现的真菌病原体中危害较为严重的属种之一[26]，可在许多经济作物中引发多种病害，例如根腐病、茎腐病、维管束枯萎病和果实腐烂病[27]。国内关于丹参根腐病的研究发现，不同地区丹参根腐病的病原菌存在一定差异。山东省莱芜地区引起丹参根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌，聊城市和四川省的病原菌则为腐皮镰刀菌[22]。本研究发现山东省蒙阴县连城镇对山庄村丹参根腐病病原菌为木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌。

唐菲菲[28]研究发现，10%苯醚甲环唑能够有效抑制由尖孢镰刀菌引起的桔梗根腐。刘昌云等[29]在防治黄连根腐病时发现25%丙环唑可有效抑制菌丝活性以及病原菌生长。张成玲等[30]研究表明，枯草芽孢杆菌在田间防治由尖孢镰刀菌引起的甘薯根腐病效果最好。本研究中，0.4 mg/L的2 000亿/克孢子枯草原粉对尖孢镰刀菌的抑制率为91.20%；3 840 mg/L的96.3%苯醚甲环唑对木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别为88.07%、79.07%；4 400 mg/L的95%丙环唑对木贼镰刀菌的抑制率为94.85%，2 200 mg/L的95%丙环唑对尖孢镰刀菌的抑制率为100%。这些试验结果为实际生产中防治丹参根腐病提供了理论依据。在用药剂防治丹参根腐病的同时，可配合其他防治措施如农业防治、生物防治等来提高丹参根腐病的防控效果。

本研究鉴定出的山东省蒙阴县连城镇对山庄村丹参根腐病的病原菌为木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌，两种病菌均能单独引起丹参根腐病，但两种病菌的生物学特性有待进一步测定。室内药剂筛选和盆栽药效试验发现2 000亿/克孢子枯草原粉、96.3%苯醚甲环唑和95%丙环唑对丹参根腐病病原菌的抑制率、10%苯醚甲环唑和40%丙环唑对丹参根腐病的防治效果较好，但是其田间防治效果、药剂残留量等问题还有待进一步研究。