超表达StRab5b基因对马铃薯耐盐生理特性的影响

范俊臣，张之为

(内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

马铃薯(Solanum tuberosumL.)是茄科茄属一年生草本植物，是我国第四大粮食作物，2020年全国29个省(直辖市、自治区)马铃薯种植面积为559.6万公顷，总产量12 294.4万吨[1]，在保障国家粮食安全和农民增收中具有不可代替的作用[2]。

马铃薯对盐中度敏感，盐害会抑制植株生长发育，甚至导致植株死亡[3]，大大降低马铃薯产量和品质，严重制约马铃薯产业发展。因此，研究马铃薯对盐胁迫的响应机理具有重要意义。

研究表明，盐胁迫下，植物叶片出现褐色或棕色斑点甚至萎蔫卷曲，叶片色素被破坏，同时气孔收缩，限制了二氧化碳进入，影响光合作用，且长期胁迫下造成根系坏死，导致植物死亡[4-6]；盐胁迫下，过量Na+、Cl-等离子对细胞产生离子毒害作用，影响植株对其他离子的吸收，而且形成的渗透压胁迫会引起细胞水势变化，导致植物失水[7，8]；此外，盐胁迫会造成植物体内大量活性氧积累，打破自由基产生与清除这一动态平衡，导致膜脂过氧化，丙二醛(MDA)大量增加，造成膜系统损伤甚至瓦解，对植物体造成严重伤害[9-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化酶系统的第一道防线，在清除活性氧过程中发挥关键作用；过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)也是植物体内重要的抗氧化酶，可与SOD共同作用清除盐胁迫下产生的活性氧和自由基，从而降低过氧化伤害[10]。因此，MDA含量及SOD、POD、CAT活性常被用作衡量植物耐盐性的生理指标。

小G蛋白(small GTPases)是一类单体GTP结合蛋白，分子量为20～30 kD，依据功能可分为5个家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran家族[12]。Rab蛋白是小G蛋白家族最大的亚家族，在膜转运过程中起着重要作用[13]，并可与效应子相互作用，在细胞生长发育、极性运输、逆境胁迫反应等中发挥重要的调控功能[14]。Tripathy等[15]发现在水稻中超表达PgRab7基因，可使植株SOD、APX和CAT活性提高，从而表现出耐盐和耐旱的特征；El-Esawi等[16]研究表明，转OsRab7基因水稻植株的相对含水量、叶绿素含量、气体交换特性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和抗氧化酶(CAT、SOD、POD、APX)活性显著高于野生型，表现出耐盐、耐旱和耐高温的特性，同时产量增加。

本研究以超表达StRab5b基因马铃薯为材料，经过NaCl胁迫处理后分析植株含水量、抗氧化酶活性及MDA含量的变化，以明确StRab5b基因在马铃薯响应盐胁迫中的调控作用，为马铃薯耐盐性研究提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年6—8月在呼和浩特市内蒙古农业大学园艺与植物保护学院分子植物病理实验室进行。供试材料为超表达StRab5b基因的马铃薯株系L7、L8、L10，品种为夏坡蒂，已经过qPCR鉴定[17]。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫处理 选取在MS固体培养基中生长4周的马铃薯组培苗，取出洗净根系，在清水中缓苗3 d，然后置于装有30 mL 150 mmol/L NaCl的组培瓶中，每瓶6株，重复3次，以转空载体马铃薯为对照(CK)，置于光照16 h、黑暗8 h、温度22℃、湿度80%条件下培养，在处理0、24、48 h采集植株样品测定相应理化指标。

1.2.2 植株含水量的测定 吸干采集样品表面水分，称鲜重，然后置于80℃烘干至恒重，称干重。按公式[18]计算含水量:植株含水量(%)＝(植株鲜重-植株干重)/植株鲜重×100。

1.2.3 生理生化指标的测定 SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[19]，POD活性测定采用愈创木酚法[19]，CAT活性测定采用紫外分光光度法[19]。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[20]。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 8软件作图，利用SPSS 26.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同时间盐胁迫对超表达StRab5b基因马铃薯幼苗含水量的影响

经过150 mmol/L NaCl处理后，观察不同时间内植株的生长，结果(图1)显示，未经胁迫时，转基因马铃薯L7、L8、L10与CK均为正常生长形态，叶片舒展未发生皱缩；胁迫处理24 h，L7、L8、L10的叶片开始轻微皱缩，而CK的叶片未发现明显皱缩；胁迫处理48 h，L7、L8、L10和CK的叶片均开始皱缩，L7、L8、L10的叶片皱缩程度明显高于CK。

图1 超表达SbRab5b基因马铃薯在盐胁迫处理后的植株表型

从图2可知，随着NaCl处理时间的延长，转StRab5b基因马铃薯与CK植株含水量均呈降低趋势。在处理0 h，CK与转基因马铃薯株系L7、L8、L10的含水量没有显著差异；处理24 h，与CK相比，L7、L8、L10的含水量分别显著下降12.5%、17.6%、24.6%；处理48 h，与CK相比，L7、L8、L10的含水量分别显著下降31.7%、36.2%、42.8%。说明盐胁迫条件下，超表达StRab5b基因降低了马铃薯幼苗的植株含水量。

图2 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的含水量变化

2.2 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的抗氧化酶活性变化

2.2.1 SOD活性的变化 如图3所示，经过150mmol/L NaCl处理后，随着盐胁迫时间的延长，转基因马铃薯L8的SOD活性先降后升，CK、L7的SOD活性呈递增趋势，而L10的活性先升后降。盐胁迫处理0 h，CK与转基因马铃薯L7、L8、L10的SOD活性没有显著差异；在处理24 h，与CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分别显著下降66.7%、81.1%、29.5%；在处理48 h，与CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分别显著下降54.4%、48.8%、80.3%。总体来说，在盐胁迫下，超表达StRab5b基因降低了马铃薯幼苗的SOD活性。

图3 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的SOD活性变化

2.2.2 POD活性 如图4所示，在150 mmol/L NaCl处理下，随着盐胁迫时间的延长，CK的POD活性呈递增趋势，转基因马铃薯L7、L10的活性呈先降后升趋势，而L8的活性先升后降。在处理0 h，CK与转基因马铃薯L7、L8、L10的POD活性没有显著差异；在处理24 h，与CK相比，L7、L8、L10的POD活性分别显著下降50.6%、16.6%、37.8%；在处理48 h，与CK相比，L8的POD活性显著下降29.1%，而L7的POD活性显著增加54.2%，L10的POD活性上升13.0%，但与CK差异不显著。可见，在盐胁迫初期，超表达StRab5b基因降低了马铃薯幼苗的POD活性，但在胁迫后期，不同转基因株系的反应不同，L8的POD活性降低，而L7和L10的POD活性升高。

图4 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的POD活性变化

2.2.3 CAT活性的变化 如图5所示，在150mmol/L NaCl处理下，随着盐胁迫时间的延长，CK与L10的CAT活性呈递增趋势，而L7、L8的CAT活性均呈先升后降的趋势。在处理0 h，CK与转基因马铃薯L7、L8、L10的CAT活性没有显著差异；在处理24 h，与CK相比，L7、L8的CAT活性分别上升45.2%、25.8%，差异显著，L10的CAT活性略有降低，差异不显著；在处理48 h，与CK相比，L7、L8、L10的CAT活性显著降低62.9%、75.7%、32.8%。可 见，盐 胁 迫 初 期，超 表 达StRab5b基因的马铃薯CAT活性升高，但在胁迫后期大幅降低。

图5 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的CAT活性变化

2.3 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的MDA含量变化

由图6可知，在150 mmol/L NaCl处理下，随着盐胁迫处理时间的延长，CK和转基因马铃薯L7、L8、L10的MDA含量均呈现递增趋势。在处理0 h，四者的MDA含量没有显著差异；在处理24、48 h，与CK相比，L7、L8、L10的MDA含量均显著增加，分别增加了193%、80%、265%和218%、179%、295%。可见，在盐胁迫下，超表达StRab5b基因马铃薯的MDA含量大幅增加，胁迫时间越长MDA含量越高。

图6 盐胁迫下超表达StRab5b基因马铃薯的MDA含量变化

3 讨论与结论

马铃薯属于盐中度敏感作物，盐胁迫对其生长的影响主要表现在使长势变弱、叶片萎蔫发黄[21]。已有研究[22]表明，在盐胁迫下，过表达抗逆基因StSnRK2.1、StSnRK2.7可明显提高马铃薯的抗逆性，其株高、鲜重及相对含水量的降幅显著低于对照。而在本试验中，随着盐胁迫时间的延长，超表达StRab5b基因的马铃薯L7、L8、L10均出现较为严重的萎蔫，植株含水量显著降低，对盐胁迫的抵抗力明显降低。

盐胁迫对植物生理生化反应的影响主要表现在渗透调节、光合作用、氧化活性等方面[23]。盐胁迫会导致植物产生大量活性氧，若不能及时清除，就会引发脂质过氧化和蛋白交联，进而损害细胞膜结构和功能的完整性，对植物细胞产生氧化毒害作用。SOD、POD和CAT能有效清除活性氧，降低活性氧对细胞的伤害[10]。本试验中，在NaCl胁迫处理48 h后，对照植株的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均明显提高，清除活性氧的能力强；但超表达StRab5b基因的马铃薯株系中SOD和CAT活性显著低于对照植株，而POD活性3个株系间表现不同，L7、L10升高，L8下降。综合推测StRab5b基因在马铃薯植株清除活性氧上表现为负调控，超表达该基因抑制了抗氧化酶的活性，使植物体清除活性氧的能力减弱。

作为膜脂过氧化的主要产物，MDA积累量与植物受逆境伤害程度呈正比关系，植物受伤害程度越小，MDA积累量越小，反之则越大[24]。张景云等[25]在盐胁迫二倍体马铃薯叶片中发现MDA含量随盐胁迫时间的延长呈逐渐升高趋势。本试验结果也表明，马铃薯植株体内的MDA含量随着NaCl胁迫时间的延长而增加，且超表达StRab5b基因的植株体内MDA积累量更高。

综上所述，在150 mmol/L NaCl胁迫下，超表达StRab5b基因马铃薯的抗氧化能力受到明显抑制，遭受盐胁迫伤害更严重，推测StRab5b基因负向调控马铃薯对于盐胁迫的抗性。