白芍总苷对肠缺血再灌注大鼠Cajal间质细胞线粒体的保护作用研究

车 轩，郭依然，赵国杰，乔光超，吴国华，冯运章

肠缺血再灌注损伤(intestinal ischemiareperfusion injury, IIRI)是一种由急性肠系膜缺血、脓毒症、创伤或者休克等过程所引起的病理生理损伤[1]。IIRI早期可能会导致肠屏障功能障碍、局部炎症，而接下来的灌注损伤可能会导致其他器官损伤、全身炎症反应综合征甚至多器官功能障碍综合征[2]。对于IIRI的相关机制目前尚缺乏明确的结论，但大部分的研究认为，这一过程与炎症反应、氧化应激以及肠黏膜细胞凋亡具有密切的关系[3-4]。Cajal间质细胞是一种分布于胃肠道神经末梢和平滑肌之间的特殊细胞，其被认为是肠道平滑肌运动的起搏点及协调者，可能通过C-kit/SCF信号参与多种肠道炎性疾病[5]。这些疾病通常会伴随着Cajal间质细胞结构、数量以及功能的改变，而Cajal间质细胞这些改变会严重影响胃肠运动功能，从而进一步加重病情[6]。近年来，Cajal间质细胞作为IIRI治疗的新靶点也引起了医学界的广泛关注。

白芍总苷是白芍的主要成分，其具有较好的抗炎、镇痛以及调节免疫的功能，常常用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、鼻炎等自身免疫性疾病的治疗中[7]。有动物实验指出，白芍总苷能够调节肠道菌群，改善机体炎症，对结肠炎大鼠具有积极的治疗作用[8]。代小兰等[9]研究也发现白芍总苷能改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的炎症反应和细胞凋亡，调节内质网应激和间质细胞线粒自噬。因此，本研究构建了IIRI模型，初步探究白芍总苷对IIRI损伤的影响以及对Cajal间质细胞线粒体的保护作用，希望为临床IIRI的治疗提供一定的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 45只SPF级4～6月龄健康雄性SD大鼠，体质量150～200 g，购自河北医科大学动物实验中心。所有动物在我院实验动物中心适应性喂养1周，室温为（25±2）℃、湿度为65%±5%，模拟昼夜12 h/12 h饲养，自由饮食饮水。本研究中的所有实验均按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，且程序均经我院动物实验伦理委员会批准。白芍总苷胶囊（商品名称：帕夫林，宁波立华制药有限公司，国药准字H20055058，规格为每片0.4 g，含芍药苷104 mg，芍药苷的含量占白芍总甙的比例＞90%）；兔抗C-kit、SCF、Cx43多克隆抗体（中国爱博泰克生物公司）。透射电子显微镜（美国FEI公司，TecnaiG220TWIN）；OLYMPUSBX-51型多功能生物显微镜（日本奥林巴斯光学有限公司）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；超薄切片机（德国LeicaEMUC7公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 将45只大鼠随机分成3组：假手术组、模型组和白芍总苷组，每组15只。将白芍总苷胶囊内容物溶于生理盐水，配置成100 mg/mL溶液，造模前7 d，按照5 mL/kg的剂量对大鼠进行灌胃，1次/d。假手术组和模型组给予同剂量生理盐水灌胃。

1.2.2 模型制备 除假手术组外，其余大鼠均建立IIRI模型。造模前禁食12 h，不禁水。使用浓度2.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30 mg/kg）。麻醉完成后将其固定于动物手术台，仰卧位，腹部脱毛，75%酒精常规消毒3次，然后于腹中线作一大约长3 cm的切口，使肠系膜上动脉充分暴露并钝性分离，使用无创血管夹将肠系膜上动脉夹闭60 min，然后去除肠系膜动脉夹，使上动脉恢复血流，再灌注120 min，模型制备完成。

1.2.3 小肠推进率测定 手术完成后12、24 h，给大鼠灌服0.1 mL墨汁，计算小肠推进率（小肠推进率=墨染肠道长度/全小肠长度×100%），肉眼观察肠管内情况。半小时后将大鼠麻醉处死，取距盲肠约5 cm的回肠组织5～6 cm作为肠样本备用。

1.2.4 小肠组织HE染色以及病理学观察 将小肠组织用生理盐水冲洗后，吸干水分。取1～2 cm肠段于10%甲醛溶液中固定48 h，然后包埋在石蜡中。将组织切成5 μm厚的切片，置于苏木精伊红（HE）溶液中染色，在光学显微镜下观察病理变化。

1.2.5 Cajal间质细胞的超微结构观察 取1 cm×1 cm小肠样本组织，冰冻后制作成切片，采用醋酸双氧铀和枸橼铅进行双重电子染色，在透射电镜下观察Cajal细胞的超微结构变化情况。

1.2.6 Western blotting检测肠组织C-kit、SCF以及Cx43蛋白水平 将一小块肠组织加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂并于冰上研磨匀浆，4 ℃条件下，以12 000 r /min离心20 min，取上层清液并使用BCA试剂盒对蛋白含量进行定量测定。随后取40 μg蛋白样品上样到10%SDS-PAGE凝胶中分离并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入一抗C-kit、SCF以及Cx43和β-actin，4 ℃条件下孵育过夜。随后用TBS-T洗涤，用山羊抗兔IgG二抗孵育。通过增强化学发光试剂检测蛋白质条带，数据采用Image软件分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以±s表示，多组比较用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白芍总苷对IIRI大鼠小肠推进率的影响 与假手术组比较，术后12、24 h时模型组大鼠的小肠推进率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，术后12、24 h时白芍总苷组大鼠的小肠推进率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 白芍总苷对IIRI大鼠小肠推进率的影响

2.2 白芍总苷对IIRI大鼠小肠组织病理学的影响假手术组大鼠在肠道组织学方面表现出正常的形态。IIRI大鼠肠道明显损伤，绒毛剥落，毛细血管充血，上皮细胞之间的间隙增加。白芍总苷组大鼠肠道损伤明显减少，黏膜间水肿、充血明显改善。见图1。

图1 白芍总苷对IIRI大鼠小肠组织病理学的影响

2.3 白芍总苷对IIRI大鼠肠组织中Cajal间质细胞超微结构的影响 假手术组胞Cajal间质细胞呈现长梭形或星形，细胞浆未见溶解，可见核分裂，且染色质分布较均匀，有丰富的线粒体；模型组的Cajal间质细胞受到严重的破坏，细胞核异常，线粒体肿胀且内嵴消失，可见较多溶酶体颗粒及粗面内质网，胞间可见缝隙连接减少，可见较多的自噬体。白芍总苷明显改善了这种变化，线粒体肿胀不明显，自噬体减少，可见缝隙连接体。见图2。

图2 白芍总苷对IIRI大鼠肠组织中Cajal间质细胞超微结构的影响

2.4 白芍总苷对IIRI大鼠肠组织中SCF、C-kit以及Cx43蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组的大鼠小肠中SCF、C-kit及Cx43蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，白芍总苷组大鼠的SCF、C-kit及Cx43蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 白芍总苷对IIRI大鼠肠组织中SCF、C-kit及Cx43蛋白表达的影响

3 讨论

肠道缺血再灌注损伤长期以来一直受到临床外科医生的广泛关注。IIRI损伤可使肠黏膜的通透性增加，上皮细胞损伤加重，肠道屏障功能降低，继而引发网状内皮系统的一系列反应，导致系统性并发症和败血症，若不及时治疗会有较高的死亡率[10]。Cajal间质细胞是一种起源于肌间神经丛周围的起搏细胞，其作用极其重要，它可以通过自发产生的节律性慢波控制肠道收缩的节点、频次与方向，引发平滑肌收缩，同时它也是肠内神经元向胃肠道平滑肌细胞传递信号的必要条件[11]。充分的证据已经证明，IIRI损伤引起的肠黏膜损伤通常伴随着Cajal间质细胞的改变，会导致肠运动功能受损[12]。

本研究建立了大鼠IIRI模型，并采用白芍总苷进行了预处理，探究了白芍总苷对IIRI的保护作用并分析其对Cajal间质细胞线粒体的影响，结果显示，与模型组比较，术后12、24 h时白芍总苷组大鼠的小肠推进率明显升高，差异有统计学意义；病理学结果也显示，白芍总苷组大鼠较模型组大鼠肠道损伤明显减少，黏膜间充血水肿、充血明显改善。上述结果提示，白芍总苷对IIRI损伤大鼠的肠动力和肠黏膜通透性具有明显的改善作用。为进一步探求其对Cajal间质细胞线粒体的作用，本研究对Cajal间质细胞进行了微观结构观察，结果显示，模型组大鼠的Cajal间质细胞受到严重的破坏，线粒体肿胀且内嵴消失，可见较多溶酶体颗粒及粗面内质网，白芍总苷明显改善了这种变化，线粒体肿胀明显减少，其表面自噬体减少。就微观结构分析，白芍总苷对IIRI损伤大鼠Cajal间质细胞线粒体具有一定的保护作用。

有研究证实，SCF、C-kit及其组成的C-kit/SCF信号通路在Cajal间质细胞的发育、分化和表型的形成中具有不可忽视的作用[13]。其中C-kit蛋白是一种由人染色4q11～12的原癌基因C-kit编码的145 ku跨膜蛋白，被广泛认为是Cajal间质细胞的特异性标记物之一[14]。而SCF作为一种干细胞和肥大细胞的生长因子，其以分泌型和跨膜型两种形式存在，可调控细胞的生长分化[15]。在Cajal间质细胞前体细胞定向分化过程中，C-kit扮演了维持其定向分化的角色，在无C-kit刺激情况下其会发育成平滑肌细胞。但这一过程中若无SCF的存在，Cajal间质细胞的生长也会受到限制。Horváth等[16]研究发现，糖尿病胃轻瘫小鼠由于胰岛素样生长因子的缺乏导致体内SCF的表达降低，而这最终引起了Cajal间质细胞的减少。SCF与C-kit结合后可能进一步激活下游信号通路，参与Cajal间质细胞细胞表型的维持和细胞的增殖。Cx43是存在于Cajal间质细胞线粒体中的蛋白，是一种主要连接蛋白亚型，主要分布于线粒体的内膜上。有研究认为，Cx43可以通过调节某些通路来调控线粒体自噬、氧化应激，从而确保线粒体自噬对线粒体功能的稳定作用[17]。本研究的结果显示，IIRI模型组大鼠小肠组织的SCF、C-kit以及Cx43蛋白表达水平明显降低，而白芍总苷组大鼠的SCF、C-kit及Cx43蛋白表达水平较模型组明显升高，差异有统计学意义。提示白芍总苷可介导SCF、C-kit以及Cx43蛋白表达，调控C-kit/SCF信号通路，保护肠组织Cajal间质细胞线粒体功能的稳定性。

综上所述，白芍总苷预处理改善了IIRI诱导的肠损伤，对Cajal间质细胞线粒体结构和功能稳定性具有保护作用，其机制可能与C-kit/SCF信号通路有关。这为白芍总苷在IIRI治疗中的应用提供了一种潜在的选择。