虹鳟传染性胰脏坏死性状全基因组关联分析

欧阳少琪,赵云峰,蒋丽*,杨润清*

虹鳟传染性胰脏坏死性状全基因组关联分析

欧阳少琪1,2,赵云峰2,蒋丽2*,杨润清2*

1. 上海海洋大学, 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306 2. 中国水产科学研究院, 农业农村部水生动物基因组学重点实验室, 北京市渔业生物技术重点实验室, 北京 100141

为了探究虹鳟传染性胰脏坏死症(Infectious Pancreatic Necrosis, IPN)抗性的遗传基础，本文采用三种二歧性状的分析方法，对来自58个全同胞家族的749尾虹鳟（271尾抗性和478尾易感），注射传染性胰脏坏死病毒后的存活情况进行全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)。关联分析结果表明，共鉴定到两个QTN与虹鳟IPN抗性显著关联，位于四号染色体和对应的Scaffold上。以这些检测到的QTNs作为探针，对比虹鳟全基因组信息，筛选得到四个候选基因，它们可能是影响虹鳟IPN抗性的重要功能基因。通过对比三种方法的检测结果，得知GRAMMAR-Lambda法对检测二歧性状QTNs的统计能力略高于SAIGE和GMMAT法，具有更好的统计性能。这些研究结果为虹鳟抗传染性胰脏坏死病毒的遗传选育提供了分子标记，为虹鳟抗传染性胰脏坏死病毒的研究提供了理论基础。

虹鳟; 胰脏; 全基因组关联分析

虹鳟系鲑形目鲑科类大马哈鱼属的重要代表性鱼类，是一种具有极高经济价值的世界性冷水养殖鱼类。由传染性胰脏坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)引起的传染性胰脏坏死症（Infectious Pancreatic Necrosis, IPN）最先于北美，后传入欧洲。1984年，IPNV首次在我国出现。随后，在我国的黑龙江、辽宁、山西、甘肃、台湾等地陆续检测出同样的病原体。2016年，四川省某虹鳟养殖场因IPVN感染导致虹鳟大量死亡，这是在我国西南地区发现的第一例由IPNV引起的鱼病[1]。时至今日，IPNV已成为制约大西洋鲑鱼和虹鳟鱼养殖业发展的主要病害之一，给我国的水产业造成了严重的损失。当感染IPNV后，鱼体是否死亡受品种、年龄、环境、遗传背景等的影响[2]，现有的研究表明，在鲑科类中，可能存在对细菌[3,4]、寄生虫[5]和病毒性疾病[6]免疫相关的显著遗传变异。这意味着有可能通过人工选育的方式，来提高鱼类对各种疾病的抵抗力，从而作为鱼类养殖的一种可行性疾病控制策略。传统育种一般采用对群体中大量个体进行性状观测的方法来选育优良后代，这一过程不仅耗时长、操作繁琐，而且效率低。基于全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)的分子辅助标记育种手段，以全基因组所有单核苷酸多态性为分子遗传标记，进行相关性分析，筛选出与性状相关联的数量性状核苷酸(Quantitative Trait Nucleotide, QTN)，精确定位主效基因，从而极大缩短了选育时间。

随着近年来算法的发展，线性混合模型(Linear mixed model, LMM)已成为GWAS广泛采用的模型之一，用于校正群体分层和亲缘相关性带来的干扰。LMM假设性状具有恒定的残差方差，而二歧性状不符合该假设，故LMM并不适用于分析二歧性状。广义线性混合模型(Generalized Linear Mixed Model, GLMM)，考虑随机多基因效应，提高了疾病性状的定位能力。近年来，出现了一些针对二歧性状的方法，试图解决某些由基因型类别或低频率事件导致的计算和分离问题。Chen H等[7]提出了GMMAT(Generalized Mixed Model Association Test)，使用logistic混合模型，并拓展了score检验，比极大似然法更快。在GLMM的基础上，Zhou X等[8]提出了SAIGE(Scalable and Accurate Implementation of Generalized Mixed Model)，将BOLT-LMM正态分布性状扩展到了二元疾病性状。Yang R等[9]将预先估计的基因组育种值视为logit回归中的已知预测因子，然后使用基因组控制值来校正关联统计检验量，从而将GRAMMAR-Lambda法拓展到复杂群体的二元疾病分析。

目前，已经在鲑鱼和鳟鱼中找到了与各种疾病抗性相关的QTL。根据两起IPVN疫情和攻毒实验结果，在大西洋鲑鱼基因组中存在着一个抗IPVN的主效QTL[10,11]。随后，在大西洋鲑鱼中还发现了一个可以与病毒结合并通过了标记辅助选择的抗IPNV候选基因[12]。已有研究表明，虹鳟种群对IPNV的抗性与收获时鱼的体重没有明确相关性。

本研究中，将虹鳟在攻毒处理后是否存活作为二歧性状，采用GMMAT、SAIGE、GRAMMAR-Lambda法进行全基因关联分析，挖掘与IPNV抗性相关的候选基因，为虹鳟IPNV抗性遗传改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验群体与表型鉴定

本实验虹鳟由ATC 巴塔哥尼亚研究中心(智利，蒙特港)提供的58条雌鱼和20条雄鱼繁殖而来，包括58个全同胞家系。相关饲养条件和更多群体管理请参阅Flores-Mara[13]，Neto[14]和Rodríguez[15]等人的文章，有关攻毒实验的详细分步方案参见Yoshida等[16]人的文章。实验期间死亡个体的表型值记为1，实验结束时仍然存活的个体表型值记为0。

1.2 基因型与质量控制

使用Palti等[17]开发的57K Affymetrix Axiom SNP芯片对749尾虹鳟的基因型进行分型，得到40150个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)。使用PLINK1.9软件(http://www.cog-genomics.org/plink2/)对基因型数据进行严格的质量控制，去除低于90%最小检出频率的个体，以及最小哈代温伯格平衡检验值小于1×10-5、最小等位基因频率小于0.01、最小检出频率低于95%的SNPs。

1.3 全基因关联分析

其中是虹鳟在实验期间死亡率的均值，为标记和群体结构以外的固定效应值矩阵，包括有年龄、性别和当前检验SNP的遗传效应，是扣除当前检验SNP后的随机多基因效应值行向量，和分别是和的指示变量矩阵。

本研究利用GRAMMAR-Lambda v1.0(URL:https://github.com/RunKingProgram/BinaryGRAMMAR-Lambda/)，以实验期间虹鳟攻毒处理后是否存活为二歧性状，进行全基因组关联分析，设置基因组显著水平(5% Bonferroni校正阈值，1.325697×10-6)。简单来说，GRAMMAR-Lambda处理二歧性状时可大致分为三步，第一步，通过全基因组标记来计算亲缘关系矩阵；第二步，构建GBLUP方程估计基因组育种值，而不是多基因效应，然后将基因组育种值作为偏移项构建线性模型；第三步，执行PLINK并使用检验统计量的平均值或中位数校正统计量。同时，使用SAIGE v0.29.5(URL:https://github.com/weizhouUMICH/SAIGE/)和GMMAT v1.3.2(URL:https://github.com/hanchenphd/GMMAT/)作为对比。结果图由R3.6.1绘制而成。

1.4 数据来源

表型数据和基因型数据由在线数据库Figshare(URL:https://figshare.com/articles/Untitled_Item/7725668/)提供。

2 结果与分析

2.1 表型和基因型数据分析

来自58个家系的749尾虹鳟，平均个体数在10～18不等，实验期间，死亡数共计271，存活数为478，累积死亡率达到36.18%，标准差为0.48，标准误为0.02。实验结束时参与实验的所有虹鳟的平均体重为2.17，标准差为0.74，标准误为0.03。共有749个样本的37716个SNP通过了质量控制。每个染色体上的SNP平均有1257个，介于591和1796之间。SNP密度分布见图1。

图 1 虹鳟IPN性状的SNP密度图

Fig.1 The SNP density map of IPN trait in

2.2 GWAS结果分析

在对GWAS结果的优劣进行评估时，通常根据QQ图和基因组控制(Genomic Control, GC)值或膨胀系数来判断分析结果的群体分层和假阳性影响。图2显示，749个个体，37716个SNP虹鳟IPNV存活数据进行GMMAT(a)、SAIGE(b)、GRAMMR-Lambda(c)分析得到的基因定位结果。比较不同分析结果下的QQ图，可知观测值和期望值均基本一致，散点分布与趋势线吻合度较高，绝大多数位点的实际观测P值贴近理论线，分别计算三种方法下的GC值（每个标记的卡方统计量的平均数），GMMAT和GRAMMAR-Lambda的GC值分别为0.996和1，表明分析结果的群体分层和假阳性影响得到了有效的控制，SAIGE的GC值为1.103，检测结果有显著的假阳性。比较不同方法的曼哈顿图，GRAMMAR-Lambda超过基因组显著水平的QTNs有2个，位于14号染色体和Scaffold上（表1），GMMAT和SAIGE没有检测到超过基因组显著水平的QTNs。

图 2 虹鳟IPNV抗性性状GWAS 曼哈顿和QQ图

(a)GMMAT; (b)SAIGE; (c)GRAMMAR-Lambda

表 1 虹鳟IPN抗性显著关联的QTNs信息

注: *表示未在虹鳟全基因组中进行功能注释的新基因。

Note: * Represent novel gene which has not found any gene function annotation in genome of.

3 讨 论

水产动物相关病害都是多基因控制的复杂性状，探索与疾病相关联的QTNs、候选基因，对解析水产动物的疾病遗传机制，利用分子辅助育种提高遗传选育效率有着重要意义。随着二代测序技术的快速发展，测序的成本也相应的降低，有关水产动物疾病性状的GWAS研究逐渐增多。尽管GLMM对离散性状具有可解释和可预测的特性，但由于求解和计算上的困难，无法有效应用于复杂疾病的GWAS。基于GLMM的关联方法，GMMAT和SAIGE，在一定程度上简化了对疾病性状的全基因组混合模型关联分析，但它们更适用于处理亲缘关系简单的群体，如人类。当研究群体的亲缘关系复杂，估计出的遗传力并不准确，此时更适合使用GRAMMAR-Lambda法。GRAMMAR-Lambda法在执行二歧性状的关联分析时，并不需要估计遗传力，在处理大样本群体时，还可通过使用少量标记来计算GRM达到全标记的效果，极大的简化了计算复杂度。

此前在大西洋鲑鱼中找到的两个IPNV抗性的QTL，其中最显著的一个位于26号染色体上，解释了29%的表型变异和83%的遗传变异[10,18]，该QTL在挪威的一个独立的大西洋鲑种群中得以证实[11]。2001年，在虹鳟中发现2个与IPNV抗性相关的QTL，分别位于3号和22号连锁群中，每个QTL可以解释约17%的表型变异[19]，随后的一项研究也证实存在着同样的QTL[20]，同时还发现了在12号连锁群中存在另一个显著的QTL。根据连锁图谱得知，这些重要标记分别位于14号染色体和16号染色体上[21]。

根据GWAS分析结果，在虹鳟全基因组上寻找高度关联的QTN附近的基因，共找到四个已知的候选基因。其中基因在神经元发育过程中起主要调节作用，此外还在介导细胞黏附和Gaq蛋白偶联受体诱导的信号通路中发挥着重要作用[22]；是一种印迹基因，其编码的Grb10蛋白，通过拮抗胰岛素信号，在哺乳动物细细胞培养中起到生长抑制因子的作用[23]；在以斑马鱼为实验动物模型时，发现基因在调节腺酸酯环酶和磷氧酶的活性过程中起着主要作用，同时与ATP二磷酸裂解酶（环化）、cAMP生成肽活性有着密切关联[24]；是一种核苷酸末端转移酶基因，在mRNA鸟苷酸化过程中，起保护mRNA免受快速去腺苷酸化的作用，此外还参与调节NTP聚合酶、聚腺苷酸合成酶、聚腺苷酸聚合酶的活性，在生物体转录过程中起重要作用[25]。这些新位点的发现对后续虹鳟传染性胰脏坏死症抗性基因的发掘以及进一步的功能验证、分子辅助选育工作具有重要意义，同时定位到的这些候选基因可能在虹鳟参与抗IPNV过程中发挥着重要作用，它们的筛选定位极大地提高了对虹鳟抗IPNV疾病遗传基础的认识。基于以上研究结果，下一步研究工作将主要集中在虹鳟IPNV抗性基因的克隆与功能验证，为虹鳟IPNV抗性遗传改良提供理论基础。

4 结 论

GRAMMAR-Lambda是一种更加实用且高效的二歧性状关联分析方法，相比于传统的二歧性状分析方法，如GMMAT法和SAIGE法，检测效率更高，计算速度更快，特别是针对亲缘关系复杂群体，无法估计遗传力或者估计遗传力有误时，有更好的效果。在虹鳟中，共鉴定到了四个候选基因，位于14号染色体上，这些候选基因可能在虹鳟参与抗IPNV过程中发挥着重要作用。

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Genome-wide Association Analysis of Infections Pancreatic Necrosis Traits in

OU-YANG Shao-qi1,2, ZHAO Yun-feng2, JIANG Li2*, YANG Run-qing2*

1.,201306,2.,100141,

In order to explore the genetic basis of resistance to infectious pancreatic necrosis (IPN) in rainbow trout, a genome wide association study (GWAS) was conducted on 749 rainbow trout (271 resistant and 478 susceptible) from 58 full sib families after injection of infectious pancreatic necrosis virus (IPN) by using three methods for analyzing binary traits. The results showed that two SNP markers were significantly correlated with the anti-infectious pancreatic necrosis virus of, located on chromosomes 14 and the corresponding Scaffolds, respectively. Using these detected QTNs as probes, we compared the whole genome information of, and four candidate genes nearby were found, which may be functional genes affecting the resistance to IPNV in. By comparing the three methods, GRAMMAR-Lambda has a slightly higher statistical ability than SAIGE and GMMAT in detecting QTNs of binary traits and has better statistical performance. These results provide molecular markers for genetic selection of anti-infectious pancreatic necrosis virus inand the molecular basis for further research of the mechanism of infectious pancreatic necrosis virus in.

; pancreas; genome wide association analysis

S917.4

A

1000-2324(2022)04-0618-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.04.018

2022-04-11

2022-04-20

动物全基因混合模型关联分析多功能优化解析策略(32072726)

欧阳少琪(1997-),男,硕士研究生,研究方向:数量遗传学. E-mail:ouyangsq7@163.com

Author for correspondence. E-mail:runqingyang@cafs.ac.cn; jiangl@cafs.ac.cn.