荧光偏振技术在生化分析检测中的研究进展

张怡雯， 韦汶言， 赵晶瑾*

(1.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学), 广西 桂林 541006；2.广西师范大学 环境与资源学院, 广西 桂林 541006)

荧光偏振(fluorescence polarization，FP)技术具有操作简单、反应快速、稳定性好等多种优势，吸引了众多学者的关注[1]。FP理论最早在1926年被发现和提出[2]。FP检测技术是通过分析体系中荧光分子的偏振信号变化差异，实现对分子间相互作用的研究以及所选目标物的检测。能引起偏振信号变化的因素很多，如反应物之间的结合强度、所形成复合物体积、质量大小、溶液性质等，偏振信号强度的变化可以通过仪器上的垂直或水平偏振器进行检测，原理如图1所示[3]。传统荧光偏振分析方法多是基于抗原与抗体结合的荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)技术，这对实际样品中痕量分析物质的精准检测带来很大限制。随着核酸技术的发展，科研人员研究利用核酸适配体作为目标识别单元，拓宽了FP技术检测的应用范围[4]，但是仍存在检测背景高或灵敏度较差等问题。近年来，科研人员借助于材料科学和标记技术的进步，从2个方面开发了一系列信号放大策略[5]来提高FP检测技术的灵敏度：一方面是利用生物大分子和纳米材料的质量放大法，放大元件如蛋白质[6]、金纳米粒子(AuNPs)[7]以及氧化石墨烯(GO)[8]等。另一方面是设计特定的体系来实现目标分子循环信号放大反应，此类方法如酶催化的目标回收循环信号放大[9]、目标催化的DNA循环自组装[10]等。这些方法的开发显著促进了荧光偏振分析技术的发展。由于FP分析技术适用于均相检测，无需分离、操作简单、快速、所需样品量少，且无毒性和放射性物质影响，因此在多学科领域具有广泛应用，如食品与环境分析[3]、生命科学研究[11-12]与高通量筛选和药物发现[13]等。

本文综述荧光偏振技术在生物小分子、核酸、蛋白质与生物酶、金属离子、农药等生化物质分析检测中的研究进展，并对其发展趋势进行展望。

图1 荧光偏振信号测量原理[3]Fig.1 Schematic representation of fluorescence polarization measurement[3]

1 荧光偏振技术在生化分析检测中的应用

1.1 生物小分子检测

图2 荧光偏振技术检测生物小分子的原理Fig.2 Schematic diagram of the principle of small biomolecules based on fluorescence polarization detection technology

生物小分子参与维持生命正常机能过程，在人体的新陈代谢、免疫、组织修复等方面发挥着重要作用，因此，针对一些生物小分子进行快速准确检测具有重要意义。半胱氨酸是人体必需的氨基酸和生糖氨基酸，是老年痴呆及心血管等相关疾病的生理调节剂[14]。现有文献报道的FP分析方法主要是利用核酸适配体实现对生物小分子的特异性识别，通过核酸信号转换，利用纳米材料的高负载优势和质量放大策略实现对目标分子的高选择性灵敏测定。Jiang等[15]利用荧光量子点(QDs)和银纳米粒子(AgNPs)作为信号输出和放大元件，实现半胱氨酸的FP检测。如图2(a)所示，核酸探针修饰的QDs和AgNPs通过T-Hg2+-T结构形成QDs-T-Hg2+-T-AgNPs复合物，分子量增大，旋转速度变慢，FP显著增强，当半胱氨酸与Hg2+结合后，QDs探针游离，FP降低。利用QDs和AgNPs的联合质量放大作用，使检测限达到11 nmol/L。基于相似原理，Zhang等[7]利用AuNPs信号增强方法，对半胱氨酸的检出限为0.5 μmol/L。Ruta等[16]基于荧光分子标记的核酸适配体特异性识别L-酪氨酸酰胺和L-精氨酸酰胺建立了FP分析检测方法，检测限为100 nmol/L。ATP是人体内一种重要的生物活性物质，是细胞代谢活动中重要的调节因子，在细胞各项生理功能中起着关键作用。Huang等[8]开发了基于核酸切刻内切酶信号放大和GO增强的FP适体传感方法，用于ATP的高灵敏度和高选择性检测，检测限为2.0 pmol/L。Li等[6]基于邻近效应，利用链霉亲和素增强荧光各向异性构建一种可通用检测小分子的新方法。Fan等[17]利用MoS2纳米片作为信号增强元件，建立一种用于ATP检测的免标记方法。如图2(b)所示，当核酸适体探针与ATP结合后，可以抵抗核酸外切酶I对核酸适体探针的水解，使嵌入有荧光染料的核酸适体探针吸附在纳米片表面，FP信号显著增强，检测限达到34.4 nmol/L。该方法利用核酸外切酶作用，有效降低了背景干扰，提高了灵敏度。

1.2 核酸检测

核酸可分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是生物体内细胞增殖、分化、发育的表达途径[18]，其中DNA含有生物体的重要遗传信息，在生物体发育和正常运转中必不可少。通过DNA杂交、DNA-蛋白质结合等方式，可实现对目标核酸的快速识别，再借助核酸信号放大技术及FP技术的高度敏感性所构建的分析方法，在提高检测灵敏度方面显示出良好的性能。Liang等[19]基于AuNP-DNA树状大分子信号放大构建了一种新型超灵敏、高选择性检测HIV-DNA的FP方法，检测限为73 pmol/L。Zhang等[9]基于目标辅助外切酶Ⅲ催化信号放大FP策略，经过酶催化循环降解核酸探针后产生明显信号差异，DNA检测限可达83 amol/L。微小RNA(miRNA)是存在于各种生物体内一类长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，在真核基因表达调控中有着重要作用。Zhu等[10]使用十面体银纳米粒子增强和链置换反应循环信号放大FP方法来检测miRNA-21，检测限为93.8 pmol/L。本课题组[20-21]在该方向也开展了研究，如利用硅纳米球为信号增强元件，再结合核酸杂交链反应构建的信号放大FP分析方法，检测限为35 pmol/L；基于链霉亲和素修饰的纳米球及T7外切酶辅助信号放大开发的新型FP方法(图3)，通过纳米材料的质量放大法和酶辅助核酸双循环信号放大策略灵敏检测miRNA-141，检测限可达到1 pmol/L。

图3 荧光偏振检测技术用于miRNA-141分析的原理[21]Fig.3 Schematic diagram of the principle of miRNA-141 based on fluorescence polarization technology[21]

1.3 蛋白质与生物酶检测

蛋白质是生命活动的主要承担者，在生物体内的新陈代谢、生长发育以及衰老过程中发挥不可或缺的作用。由于蛋白质本身质量和体积相对较大，可直接利用免疫识别方法对其进行FP检测，也可利用核酸适配体特异性识别功能，当荧光染料修饰的适体探针与目标蛋白质形成复合物后，质量发生有效增加，FP值变化显著。如Nishiyama等[22]通过荧光偏振免疫分析(FPIA)快速定量检测人血清中新型冠状病毒抗体。Zhang等[23]设计一种新颖的基于核酸适体与蛋白质结合使偏振信号减小的方法，实现血液蛋白中凝血酶的灵敏测定。生物酶多数由蛋白质组成，参与生物体内的新陈代谢、能量转换等进程，目前FP技术已被应用于多种生物酶的分析测定，如凝血酶[22-24]、端粒酶[25]、唾液溶菌酶[26]、末端脱氧核苷酸酶[27]、脱氧核糖核酸酶(DNase)[28]、DNA糖基化酶[29]等。这些方法多数是利用酶底物链和其荧光标记的互补链杂交前后所引起偏振信号的差异来实现对酶活性的灵敏检测。Li等[24]基于TiS2纳米片的信号增强效应开发一种酶催化放大的FP分析策略，实现对叶酸受体和凝血酶等生物分子的检测。Zhang等[27]提出基于框架核酸包裹蛋白质无机杂化纳米花增强的三级信号放大FP传感策略，用于定量和定性检测末端脱氧核苷酸转移酶，检测限达到0.023 U/mL。Choi等[28]在基于液滴的微流控芯片中通过无共轭FP分析DNase的活性，成功确定乙二胺四乙酸抑制DNase活性的半数最大抑制浓度(IC50)为1.56 mmol/L。

1.4 金属离子检测

重金属污染不仅会使生态环境恶化，也会通过生物积累作用危害人类健康。铅离子(Pb2+)是常见的有毒重金属离子之一，会损害人体肾脏、免疫系统和中枢神经系统[30]。通过FP技术检测Pb2+的报道较多[31-33]，如Yin等[31]通过AuNPs负载的荧光核酸探针和金属核酸酶切割作用，建立一种高灵敏的FP分析法。如图4(a)所示，当目标离子被相应DNA酶序列识别后，核酸酶催化底物荧光探针断裂，使含有荧光分子的一端释放到溶液中，荧光分子脱离AuNPs后其FP信号减小。该方法通过改变核酸探针序列能够特异性识别检测Pb2+和Cu2+。汞离子(Hg2+)是环境中毒性最强的重金属之一，其毒性可通过食物链高度富集和放大[34]，开发灵敏的汞离子分析方法意义重大。Ye等[35]同样利用AuNPs作为FP信号增强元件实现Hg2+的特异性检测(图4b)，当荧光探针通过T-Hg2+-T配位作用与AuNPs形成复合物后，由于AuNPs在复合物中的质量增强效应，FP信号显著增大，方法检出限为1.0 nmol/L。Zhang等[36]利用K+介导的G-四链体增强设计了基于Cds-CdTe量子点的新型多功能FP传感器用于Hg2+的检测，检测限为8.6 nmol/L。FP检测方法也被应用于其他重金属离子的检测，如Cu2+[31,37-38]、Ag+[11,39-41]、Cd2+[42]等。本课题组[37]通过点击化学连接效应和二氧化硅量子点辅助FP信号增强开发一种检测Cu2+的新方法。Qi等[40]基于荧光染料嵌入不同碱基与Ag+结合后核酸探针信号的差异变化，设计一种以二氧化锰纳米片辅助信号增强的FP方法，实现对Ag+的灵敏测定，检测限为9.1 nmol/L。相对于基于原子吸收等大型仪器的金属离子检测方法，FP技术具有仪器操作简便、反应快速、样品需求少、毒性废物产生量低等优势，再结合多种信号放大方法，使FP技术在金属离子分析检测领域得到很好的应用。

图4 荧光偏振技术检测金属离子的原理Fig.4 Schematic diagram of the principle of metal ion based on fluorescence polarization detection technology

1.5 农药及抗菌药物检测

农药的过量使用不仅会造成生态环境的破坏，还会造成大量农药残留，威胁人类的生命健康。抗生素及抗菌药物能有效治愈各种细菌感染性疾病，但滥用抗生素及抗菌药物也会对人体产生严重危害[43]。目前，应用FPIA对农药残留检测的技术已有40多年的发展，现已基本成熟[44]，适用于多种污染物的快速检测，表1总结了近年来FPIA在农药残留检测中的应用[45-55]。其中Eremin课题组[56]做出许多贡献，他们建立了三嗪类、苯氧乙酸类、磺酰脲类除草剂等多种农药的FPIA检测方法。FPIA也被用于农药代谢物的研究，如Shim等[57]建立了6-氯烟酸的FPIA检测方法，检出限为4 mg/L。1990年，我国首次建立了血清中庆大霉素[58]的FPIA检测方法，检测灵敏度达0.3 mg/L。随之将FPIA应用于卡那霉素、新霉素及磺胺嘧啶抗菌药[59-63]的检测，取得一定成果。相较于FPIA，基于适体识别或核酸信号放大构建的FP技术显示出更灵敏、检出限更低的分析效果。Ma等[64]构建了一个基于核酸适配体识别的简单、无标记FP传感方法检测氯霉素，检测限为0.06 nmol/L。本课题组[65]也将FP检测方法成功应用于有机磷农药(OPs)的分析测定，通过农药对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用以及纳米片的信号增强效果，使该策略的灵敏度显著提高，对有机磷农药二嗪农的检测线性范围是0.01～20 μg/L，检测限为0.01 μg/L。

表1 近年来 FPIA 在农药残留检测中的应用

1.6 其他相关物质检测

FP技术在生化相关物质如真菌毒素、肿瘤标志物[66-68]、细胞因子[69-70]等方面的检测同样具有一定优势。真菌毒素是真菌在食品或饲料中生长产生的代谢物，对生命健康危害极大，如赭曲霉毒素和黄曲霉毒素都是引发肾癌、肝癌等疾病的剧毒物质。已有文献[71]报道了基于免疫反应的FPIA技术可用于真菌毒素的竞争性检测。在最新的FPIA研究中，Nakamura等[72]结合微流控装置和便携式FP分析仪，成功利用FPIA对8种谷物和小麦类食品中脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)进行快速、简便地检测，标准溶液中DON的检出限为0.035 μg/L。Huang等[73]分别合成了4种荧光示踪剂优化FPIA方法用于检测水稻样品中的赭曲霉毒素A(OTA)，检测范围为0.03～0.78 μg/L。Wang等[74]建立一种基于多克隆抗体的快速、廉价FPIA法测定饮料中替那唑酸，检出限为0.13 μg/L。基于生物传感技术构建的FP检测方法，如：Li等[75]利用赖氨酸罗丹明B标记的OTA，分别设计信号减弱和信号增强型2种FP分析方法，实现对OTA的灵敏快速测定。Huang等[76]基于核酸等温指数扩增，发展一种新颖的FP分析策略，以黄曲霉毒素B1(AFB1)为实验模型，证明该策略的可行性。Ye等[77]利用GO增强检测信号构建基于核酸适体的FP法，实现低成本、高灵敏地检测AFB1，检测限为0.05 nmol/L。

外泌体主要来源于细胞内特异性分泌的多囊泡体，参与机体免疫应答、细胞通讯等方面。但来自肿瘤细胞的外泌体会介导细胞间遗传信息传达，促进肿瘤的生长与侵袭[78]。因此，外泌体的检测对癌症疾病研究和治疗具有重要意义。Zhang等[66]利用标记有荧光分子的适体探针与外泌体的特异性结合实现FP信号差异，巧妙地利用外泌体本身的囊泡结构作为质量放大信号，达到快速灵敏的外泌体检测效果(图5)。此外，FP技术在检测外部细胞损伤方面也有一定应用。当细胞膜内物质受到损伤后，膜内活性物质会发生改变，影响细胞膜的流动性[79]。如果直接把荧光素标记在细胞膜上，受损伤的细胞膜流动性发生变化，其FP值也会随之发生变化。基于此原理可快速检测出体内损伤的细胞，目前已用于检测CT26细胞[80]、心肌细胞[81]、胃细胞[82]等。

图5 荧光偏振检测技术用于外泌体分析的原理[66]Fig.5 Schematic diagram of the principle of exosomes based on fluorescence polarization detection technology[66]

2 总结与展望

荧光的偏振性对于分子质量、体积、结合和解离都非常敏感，由此而发展的FP技术具有简便快速、直观灵敏等优势。本文简要介绍荧光偏振技术的原理及其在生化分析检测领域中的应用。传统的方法主要基于抗原与抗体结合的荧光偏振免疫技术，但是随着核酸技术和纳米材料的发展，研究者们已经开发出敏感性更强、灵敏度更高的荧光偏振分析技术。同时为获得更佳的分析效果也可以与其他技术手段相结合发展联用技术，如：可用于多组分分析的时间分辨荧光偏振技术(TRFPA)[83]、时间分辨荧光各向异性成像技术(TR-FAIM)[84-85]、毛细管电泳激光诱导荧光偏振(CE-LIF-FP)[86]等。不过，该技术的应用仍然存在易受干扰、标记成本较高等局限。因此，开发稳定性强、成本更低、功能多样的荧光偏振检测技术将成为未来关注的重点。目前的发展主要呈现以下几个趋势：1)选取多元化的偏振信号增强元件。除了选择蛋白质、核酸以及纳米颗粒、纳米片等具有较大质量的增强元件，还可以随着新材料等研究的进步，继续开发新型的信号增强元件，提高检测稳定性和灵敏度、扩大检测范围。2)发展新型无标记检测模式。该技术不仅检测成本低、分析速度快和操作简便，还有利于实现对分析样品的直接测定。3)开发便携的小型化仪器。实际样品在采集运输过程中可能受到污染，影响检测的准确性，便携小型化仪器对工作环境适应力强，可现场实时定量检测分析物。4)拓展应用于复杂的实际样品中。实际环境中检测技术易受环境变化和干扰物的影响，提高FP分析方法的选择性，使其在复杂的实际样品中具有广泛适用性。