EBPR 工艺污泥中聚磷菌多样性与除磷潜力评价方法

郑少奎，罗焇湝

北京师范大学环境学院，水沙科学教育部重点实验室，水环境模拟国家重点实验室，北京 100875

地表水体富营养化会造成藻华现象、打破水环境生态平衡，氮和磷浓度过高是藻华现象的诱因，其中磷是主要限制因子[1-2].污水处理厂是地表水体磷污染控制的关键节点，在不同除磷技术中，强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal,EBPR)工艺因为经济性、可持续性等优点在全世界污水处理厂得到了广泛应用[3-5].EBPR 工艺特指在厌氧-好氧交替运行条件下活性污泥中某些能够“超量吸磷”的微生物将水相中PO43—吸收并以胞内多聚磷酸盐颗粒(polyphosphate,Poly-P)形式转移到污泥相中，最终通过排泥实现污水除磷的工艺目标[1].早在1975 年，Fuhs 等[6]注意到不动杆菌属(Acinetobacter)细菌占优势的生活污水处理工艺存在超量吸磷现象，该“超量吸磷”微生物被命名为聚磷菌(polyphosphate accumulating organism,PAO)，在很长时间内Acinetobacter属被认为是EBPR 工艺优化研究的目标PAO[7].1976 年Barnard 等首次提出了经典的PAO“厌氧释磷-好氧摄磷”机理[8]，并获得了广泛认同.1999 年Hesselmann等将一株原Rhodocyclus属PAO重新命名为“Candidatus accumulibacterphosphatis”[9]，后续调查表明实验室EBPR 工艺中Accumulibacter属普遍存在超量吸磷现象[10]，世界上许多国家不同工艺污水处理厂该属均具有较高的丰度(占细菌总数的4%～22%)[11-12]，至此Accumulibacter属取代Acinetobacter属成为近20 年来EBPR 工艺优化研究的目标PAO.

随着越来越多PAO 新菌株被分离出来和PAO生理生化研究的不断深入，尤其是反硝化聚磷现象的发现，为充实、完善EBPR 机理提供了丰富的理论基础.在非PAO 菌占优势、非PAO 菌具有初步除磷能力的活性污泥中，准确识别、评价所有PAO(而不仅仅是此前研究聚焦的Accumulibacter属和Acinetobacter属PAO)的除磷潜力是阐明EBPR 工艺运行机理、针对性地开展EBPR 工艺参数优化升级研究的关键，而准确评价所有PAO 除磷潜力的前提是必须阐明活性污泥中PAO 多样性特征(当前研究主要以分子生态学手段开展除磷潜力评价).该文选择“phosphorus removal”“polyphosphate-accumulating organisms”和“phosphate-accumulating organisms”作为关键词，在Web of Science 数据库内检索了1980—2021 年在国际期刊上发表的生物除磷相关文献(＞1 000 篇)，据此综述了近40 年来EBPR 机理变迁，基于EBPR 工艺中分离得到的全部PAO 菌株信息归纳总结了PAO 多样性特征(相关中文论文数量较少，未作为主要数据来源)，以此为依据客观评价了当前活性污泥PAO 除磷潜力评价方法的不足，并展望了未来重点研究方向，这些研究成果对于推动EBPR 工艺优化升级具有非常重要的理论与实际意义.

1 EBPR 机理变迁

在传统EBPR 机理中，PAO 在厌氧条件下将胞内多聚磷酸盐颗粒(polyphosphate,Poly-P)分解为PO43—后释放到水中，利用糖原以及Poly-P 分解产生的能量，吸收挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)(以乙酸为代表)，并以聚-β-羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)这种内碳源物质形式储存在细胞内；在好氧条件下，PAO 以分子氧(O2)作为电子受体氧化储存的PHA 获得能量，用来吸收水中PO43—并将其转化为胞内Poly-P，同时完成生物质生长和糖原合成[13]，具体生化途径如图1 所示.

随着PAO 生理生化研究的不断深入，传统EBPR机理近年来受到了较多质疑.例如，作为EBPR 工艺优化研究的目标PAO 属，多个Acinetobacter属菌株生理生化特征的研究表明，其在厌氧条件下并没有吸收乙酸合成PHA，不符合传统EBPR 代谢模型[15]；1985 年Ohtake 等[16]在好氧-厌氧-好氧交替培养试验中发现，Acinetobacter calcoaceticusStrain IAM 12087T在厌氧环境下并没有显著吸收乙酸，同时厌氧环境并不能激发这种PAO 在好氧环境下的聚磷能力；Daly等[17]发现，无厌氧预培养时，Pseudomonassp.PHR6在好氧下培养48 h 后即出现显著的生物聚磷现象；Yadav 等[18]将12 种PAO 直接投加到好氧连续搅拌釜式反应器后观察到了显著的生物聚磷现象.

反硝化聚磷现象的发现丰富了EBRP 机理的内涵.1988 年，Vlekke 等[19]发现，单独使用NO3—作为唯一电子受体同样可以诱导生物聚磷现象的发生(即某些反硝化细菌具备生物聚磷能力).随后很多研究均证实了该现象的普遍存在：一些PAO 除了可以在好氧条件下过量摄磷以外，还可以在缺氧(DO 浓度小于0.5 mg/L)状态下利用NO3—或NO2—作为电子受体氧化细胞内储存的PHA，同时完成过量摄磷，该过程被称为反硝化聚磷，相关微生物被称为反硝化聚磷菌(denitrifying phosphate accumulating organism,DPAO)[20].研究者提出的厌氧-缺氧除磷的具体生化途径如图2 所示，厌氧段DPAO 的生化代谢途径与PAO 相同；在缺氧段，DPAO 利用NO3—/NO2—代替O2作为电子受体氧化PHA 获得能量，完成PO43—吸收和Poly-P 合成、细胞生长、合成糖原等反应，也就是在缺氧段同时实现了反硝化脱氮和聚磷[21].在这个过程中，PHA 不仅为PO43—吸收和Poly-P 合成提供能量，同时还为反硝化反应提供碳源[22]，实现了一碳两用[23]，与传统生物脱氮除磷工艺(如A2O 工艺)相比，可节省50%左右的碳源、30%的供氧量，同时减少50%的污泥产量[24].

2 基于PAO 分离菌株信息的EBPR 工艺活性污泥PAO 多样性特征

据统计，目前从不同污水EBPR 工艺活性污泥中共分离出142 株PAO 菌株(包括70 株DPAO)，其信息整理后如图3 所示.由图3 可见，活性污泥中PAO广泛分布于变形菌门、放线菌门、厚壁菌门以及芽单胞菌门，并以变形菌门为主(82%)，系统发育差异极大，具有异常丰富的多样性.这些PAO 共分属于42个菌属，其中Acinetobacter属PAO 占比最高(29%)(也是最早发现的PAO 属)，其次为Pseudomonas(15%)、Tetrasphaera(4%)、Alcaligenes(4%)属.尽管近20 年来EBPR 工艺优化研究聚焦于Accumulibacter属，但统计结果中Accumulibacter属PAO 较少，这可能与该属PAO 难以分离培养[26]有关.在上述PAO 属中，Acinetobacter属中还包含了最多(27%)的DPAO，全部PAO 菌株中共有83 株已定种.

2.1 变形菌门(Proteobacteria)

目前从EBPR 工艺活性污泥中分离得到的变形菌门PAO分属于α变形菌纲(10%)、β变形菌纲(23%)和γ变形菌纲(67%)等3个菌纲.其中，α 变形菌纲PAO 分属于2 个菌目5 个菌科Agrobacterium、Paracoccus、Rhodobacter等6 个菌属，其中Paracoccus属PAO 占比最高，达到33%；β 变形菌纲PAO 分属于3 个菌目8 个菌科Alcaligenes、Dechloromonas、Delftia等13 个菌属，其中Alcaligenes属和Brachymonas属PAO 的占比(19%)最多；γ变形菌纲PAO分属于5个菌目7个菌科Acinetobacter、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas等10 个菌属，其中Acinetobacter属PAO 占比(54%)最多.α 变形菌纲已定种的PAO共5 种(该研究中亚种或变种归入同一种，下同)，包括(受论文篇幅所限未提供相关引文，根据菌名可检索到相关文献，下同)Agrobacteriumradiobacter、Agrobacterium tumefaciens*、Ochrobactrum anthropi*、Paracoccus denitrificans*和Rhodobacter sphaeroides(*指该株PAO 同时也是DPAO，下同).β 变形菌纲已定种PAO 共8 种，包 括Alcaligenes denitrificans、Aquaspirillum dispar*、Burkholderia cepacia*、Casimicrobium huifangae、Dechloromonas aromatica、Delftia acidovorans*、Delftia lacustris*和Delftia tsuruhatensis*.γ 变形菌纲已定种PAO 共25 种，包括Acinetobacter bouvetii*、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii*、Acinetobacterlwoffi、Acinetobacteroryzae*、Acinetobacter tandoii*、Aeromonas hydrophila*、Aeromonas media*、Aeromonas salmonicida*、Citrobacter portucalensis*、Enterobacter cloacae*、Moraxella lacunata、Klebsiella oxytoca*、Pseudomonas aeruginosa*、Pseudomonas fluorescens*、Pseudomonas mendocina、Pseudomonaspseudoalcaligenes*、Pseudomonas putida*、Pseudomonas putrefaciens、Pseudomonas simiae*、Pseudomonas stutzeri*、Pseudoxanthomonas mexicana*、Serratia marcescens和Shewanella putrefaciens*.

2.2 放线菌门(Actinobacteria)

目前从EBPR 工艺活性污泥中分离得到的放线菌门PAO 分属于3 个菌目7 个菌科Tetrasphaera、Microlunatus、Aureobacterium等9个菌属，其中Tetrasphaera属PAO 占比最多(29%).已定种PAO共6 种，即Aureobacterium saperdae、Corynebacterium variabile、Microlunatus phosphovorus、Tetrasphaera australiensis、Tetrasphaera elongata和Tetrasphaera japonica.

2.3 厚壁菌门(Firmicutes)

目前从EBPR 工艺活性污泥中分离得到的厚壁菌门PAO 分属于1 个菌纲2 个菌目3 个菌科Bacillus、Staphylococcus和Streptococcus等3 个菌属，其中Bacillus属PAO 占比最多(50%).已定种PAO有4 种，即Bacillus cereus*、Bacillus subtilis*、Staphylococcus aureus和Staphylococcus auricularis.

2.4 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)

目前从EBPR 工艺活性污泥中分离得到的芽单胞菌门PAO 仅有1 株，即Gemmatimonadetes 纲Gemmatimonadales 目 Gemmatimonadaceae 科Gemmatimonas属Gemmatimonas aurantiaca.对比生物脱氮系统异养硝化菌株信息[27]，发现许多上述PAO 菌种被报道同时具备反硝化能力，也就是异养硝化聚磷菌，包括Acinetobacter junii、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas fluorescens、Alcaligenes denitrificans、Klebsiella oxytoca、Paracoccus denitrificans、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Aeromonas salmonicida和Enterobacter cloacae.

3 EBPR 工艺活性污泥PAO 除磷潜力的评价方法

EBPR 工艺中活性污泥除磷能力主要通过PAO超量吸磷作用实现，而非PAO 菌因巨大的数量优势其生长过程也能够提供一定的除磷能力，在这种情况下准确地识别、评价活性污泥PAO 除磷潜力将是推动EBPR 工艺优化升级的关键.调研结果表明，目前绝大多数研究分别根据活性污泥中PAO 丰度、胞内Poly-P 含量、PAO 代谢活性的差异来评价活性污泥PAO 除磷潜力，这3 种方式占目前相关研究的比例分别为76%、13%和11%.其中，PAO 丰度、胞内Poly-P 含量是活性污泥PAO 生物聚磷作用的直接体现，PAO 丰度或胞内Poly-P 含量越高，活性污泥PAO 除磷潜力就越大，PAO 对EBPR 工艺除磷效果的贡献就越大.相比之下，活性污泥PAO 代谢活性(如好氧吸磷速率、厌氧释磷速率[28-29]、碳源吸收速率、PHA 利用速率[30]、ATP 或NADPH 产生量[8]等)则是活性污泥PAO 除磷潜力的间接反映.此外，笔者以“metagenome、polyphosphate”与“metabonomics、polyphosphate”作为摘要及关键词在Web of Science数据库内合并检索，共得到11 篇不同领域文献，表明宏基因组学与代谢组学在PAO 功能与性能分析中虽有所应用，但研究较少.因此，本文重点综述EBPR 工艺活性污泥PAO 丰度、胞内Poly-P 含量检测方法的研究现状.

3.1 PAO 丰度检测方法

调研表明，活性污泥PAO 丰度检测主要依托荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization,FISH)、高通量测序或变性梯度凝胶电泳、定量PCR 等分子生态学检测手段，相关研究分别占文献总数的67%、20%和13%.

准确的FISH 检测结果取决于特异性探针的全面性和特异性.2000年Crocetti等设计了针对Accumulibacter16SrRNA不同靶向序列位点的PAO462探针、PAO651 探针和PAO846 探针[10]，是采用FISH 法检测污泥PAO 丰度时应用最广泛的3 种特异性探针，更常见的做法是将上述3 种探针等量混合制成PAOMIX探针以提高Accumulibacter丰度检测的准确性[31-34]，而其他PAO 探针的研究与使用则较为少见(见表1).例如，Li 等[31]采用PAOMIX探针检测了缺氧-好氧SBR 反应器中Accumulibacter的丰度，视野中大多数细菌被标记上了荧光，据此认为污泥中Accumulibacter具有较高丰度.然而，鉴于EBPR工艺活性污泥中PAO 具有丰富的遗传多样性，当上述探针仅定量Accumulibacter属而不能覆盖全部PAO 属时将严重影响探针的全面性，导致检测得到的PAO 丰度结果存在被低估的可能性.

表1 EBPR 工艺活性污泥PAO 丰度检测常用探针及序列Table 1 Common probes and sequences labeling PAO in EBPR process

以高通量测序或变性梯度凝胶电泳技术为手段的活性污泥PAO 丰度检测方法，通常基于PAO 所在属的丰度来推测活性污泥中PAO 总丰度.例如，Islam 等[35]采用高通量测序技术在侧向流缺氧-好氧-厌氧处理系统中发现了Candidatus accumulibacter、Tetrasphaera、Rhodocyclus和Dechloromonas等属，比较这些属的丰度水平后认为PAO 以γ 与β 变形菌纲为主.Dong 等[36]采用高通量技术在处理城市污水的厌氧-好氧-缺氧SBR 反应器中检测到Candidatus accumulibacter、Bacillus及Pseudomonas等属，根据各属丰度的变化情况，推测添加三氯苯氧氯酚导致PAO 丰度下降.然而，这种基于PAO 所在属的丰度来推测活性污泥中PAO 总丰度的研究结果存在较大的不确定性.例如，研究表明Acinetobacter junii是一种PAO[37]，而同属的Acinetobacter seohaensis却不能完成超量聚P 过程[38]，在这种情况下，以这两株菌所在属的丰度作为该属PAO 丰度时其结果存在高估的可能性.另外，由该文总结的EBPR 工艺活性污泥PAO 多样性结果可以看出，几乎所有依托高通量测序或变性梯度凝胶电泳技术结果总结PAO 总丰度时，其所参考的PAO 属类型严重不足，在这种情况下得到的活性污泥PAO 总丰度结果还存在被低估的可能性.

酶是PAO 生物聚磷反应的物质基础，包括多聚磷酸盐激酶(PPK)、磷酸转移酶(PAP)、外切聚磷酸酶(PPX)和内切聚磷酸酶(PPN)在内的多种酶共同参与并调控了胞内Poly-P 的合成和分解代谢[39]，其中PPK 酶可细分为PPK1、PPK2、PPK3 和PPK4 酶(PPK4 存在于真菌中[40]，该文不作为重点)等4 种类型[41].PAP〔以Poly-P 作供体，将腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)转化为二磷酸腺苷(ADP)[42]，见式(1)〕、PPX〔释放Poly-P 链末端的磷酸基团，同时释放出能量[43]，见式(2)〕、PPN〔催化长链Poly-P 逐步裂解生成大量的短链Poly-P[44]，见式(3)〕、PPK2〔以Poly-P 作为磷酸基团供体将二磷酸鸟苷(GDP)合成三磷酸鸟苷(GTP)[45]，见式(4)〕、PPK3〔以Poly-P 作为磷酸基团供体将二磷酸胞苷(CDP)转化为三磷酸胞苷(CTP)[46]，见式(5)〕均参与Poly-P 降解反应.只有PPK1 是胞内Poly-P 合成的关键酶，它催化三磷酸腺苷(ATP)末端的磷酸基团可逆地转移到长链Poly-P 上，形成长度更长的正磷酸盐线状或环状多聚物[47]，如式(6)所示.

式中，ARP(F)为球状肌动蛋白，ARP(G)为丝状肌动蛋白.

PPK 酶由ppk功能基因编码，根据PPK 酶分型ppk基因同样可分为ppk1、ppk2、ppk3及ppk4共4种类型，针对这些功能基因设计特异性、通用性引物是开展定量PCR 检测PAO 丰度的基础.早在20 世纪90 年代，研究者们分别克隆和分析Klebsiellasp.[48]、Pseudomonassp.[49]和Acinetobactersp.[50]等细菌的ppk基因.在Web of Science上分别以“ppk1”“ppk2”“ppk3”及“ppk4”进行标题、摘要和关键词的合并检索，截至2021 年笔者检索到的文章数量分别为154、92、8 和4 篇，表明关注点主要焦聚在ppk1基因上，同时超过80%的ppk1引物应用仅仅针对Accumulibacter属ppk1基因，被用来研究EBPR 工艺Accumulibacter属的群落结构和种群动态(如Accumulibacter各进化枝的丰度和类型)[35,51-52]，相比而言，针对所有PAO 的ppk1基因的通用性、特异性引物则较为少见(见表2).这些针对Accumulibacter属ppk1基因的特异性引物将该属细菌划分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型又分为ⅠA、ⅠB、ⅠC、ⅠD 和ⅠE 支系，Ⅱ型则包括ⅡA、ⅡB、ⅡC、ⅡD、ⅡE、95ⅡF、ⅡG、ⅡH 和Ⅱ-Ⅰ，共14 个进化枝[52].其中，引物对Acc-ppk1-254f 和Acc-ppk1-1376r由Mcmahon 等[53]于2007 年设计，它能扩增出1 123 bp 基因片段，而He 等[54]于2007 年针对Acc-Ⅰ、Acc-ⅡA、Acc-ⅡB、Acc-ⅡC 以及Acc-ⅡD 等进化枝分别设计的引物对成为目前研究与应用最多的引物对.如Zeng 等[51]利用引物对Acc-ppk1-254f 和Accppk1-1376r 调查了3 个污水处理厂活性污泥中Candidatus accumulibacter的群落结构，结果显示，Candidatus accumulibacter在A2O 系统中占全部微生物的26%，且冬季丰度显著高于夏季；进一步对Accumulibacter各进化枝引物对的调查发现，所有系统中Acc-Ⅱ型占据显著优势，丰度达到2.59×109cells/(g MLSS)，占Accumulibacter总量的87.3%.然而，如第2 节所述，活性污泥中PAO 具有丰富的遗传多样性，在此情况下，仅仅以Accumulibacter属为研究对象存在不全面的问题.

表2 活性污泥PAO 的ppk1 基因常用引物及序列Table 2 Common amplification primer pairs and sequences targeting ppk1 gene

与Accumulibacter属ppk1基因引物设计和应用现状相比，针对活性污泥中PAO 多样性设计的ppk1基因通用引物的研究工作相对较少，影响力也不足.2002 年Mcmahon 等基于12 个PPK1 酶的氨基酸序列开展了ppk1基因通用引物的设计，这对引物被命名为NLDE 和TGNY，它能够扩增长度约为1 300 bp的ppk1片段[55]，在不同城市污水处理厂的活性污泥样品检测中只获得了少数几种PAO 基因信息[56].2009 年Mehlig 等[56]根据NCBI 中Ralstonia eutropha(AAZ65185)、Neisseria meningitidis(CAB83848)、Acinetobactersp.(CAA86935)、Propionibacterium acnes(YP_055056)、Nocardia farcinica(BAD59057)和Brucella abortus(YP_221494)的PPK1 酶氨基酸序列设计了引物对ppk1-FW 和ppk1-RW，该引物对可扩增出长度约为1 100 bp 的基因片段，相较于NLDE和TGNY 引物对能够检测到更多的ppk1序列.该文的调研结果显示，这两种引物设计时并未全面覆盖活性污泥PAO 多样性，其特异性和通用性均尚待验证.然而，除此之外，尚未见到其他ppk1基因通用引物的研究.因此，以EBPR 工艺活性污泥PAO 多样性为依据，开展以ppk1基因的新通用引物设计研究具有十分重要的理论与实际意义.

3.2 胞内Poly-P 含量检测方法

某些特定的染色剂，如4',6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)[57]、奈氏试剂(neisser)[58]、亚甲基蓝(methylene blue)[59]、盐酸四环素[60]等，能够与胞内Poly-P 发生选择性反应，从而可以直接观测到染色后的胞内Poly-P.由于染色法简便易行，通常被用于胞内Poly-P 的定性分析，其中DAPI 应用最为广泛，其结果可作为定量结果的参考.已有研究显示，采用电子能量损失谱和核磁共振技术，分析细胞超微结构细节与元素组成信息，也观察到了Poly-P 颗粒[61]，但应用较少.

调研表明，以非PAO 为主的活性污泥中磷含量一般为污泥干质量的1.5%～2%[62]，而EBPR 工艺中污泥磷含量可以达到污泥干质量的4%～8%，在某些情况下甚至可以达到10%～15%[10].污泥磷含量可以一定程度上反映出系统的吸磷能力，但是并不能直接反映PAO 对除磷的贡献.相比之下，测定胞内Poly-P含量能够直接反映PAO 在EBPR 工艺除磷效果上的贡献.传统的Poly-P 含量分析检测手段包括萃取-正-磷分析法[63]、提取纯化方法[64]、拉曼光谱[65]、X 射线[66]、凝胶电泳[67]、蛋白质亲和力[68]以及Poly-P 消耗法[69]等.然而，这些传统分析方法通常需要复杂的提取和预处理过程，效率不高；加之强酸在消化过程中的使用，使得所有形态的磷都可以转化为PO43—，导致Poly-P 含量被高估.Feng 等[70]发现，pH=8 时添加1%的EDTA 获得了最高的PO43—释放量，Poly-P 含量测定具有简单、高效、准确等优点，是目前较为先进的胞内Poly-P 定量检测方法，但该方法以活性污泥作为研究对象，未区分PAO 和非PAO 的相关特征，其准确性和适用性还有待评价.

4 结论与展望

a) EBPR 新机理.目前还需要持续开展PAO 新菌株的生理生化研究，探讨更多PAO 菌株的厌氧内碳源合成特征、厌氧释磷意义、反硝化聚磷能力等菌株特征，为EBPR 机理提供更充分、更全面的基础数据.另外，在解决PAO 除磷潜力评价方法准确性的基础上，需要加强以工艺试验为基础的EBPR 机理的验证研究，包括反硝化除磷、厌氧释磷的必要性等内容，并形成相应的操作规程.

b) PAO 通用引物设计与评价.应基于EBPR 工艺PAO 丰富的系统发育多样性，开展目前PAO 通用引物的通用性和特异性评价工作，探讨目前PAO 通用引物对已发现的42 个菌属83 株已定种PAO 菌株的检测效果以验证其通用性，并在必要条件下开展PAO 新通用引物的设计和评价，为准确评价EBPR工艺中活性污泥PAO 除磷潜力提供有效的检测手段.

c) 胞内Poly-P 含量EDTA 检测方法校准.应以非PAO 菌株为对照(不是活性污泥)，采用EDTA 定量检测方法，检测到PAO 菌株在摄磷过程中无Poly-P颗粒、有Poly-P 颗粒，但无法染色观察、清楚观察到Poly-P 颗粒等临界条件下胞内Poly-P 和TP 的含量，为该检测方法提供可供参考的边界数据.