血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在腰椎间盘突出组织中的表达及意义*

潘媚，朱义芳，巫娟

(1.四川省骨科医院 病理科，四川 成都 610041；2.四川省骨科医院 检验科，四川 成都 610041)

腰椎间盘突出(LDH)是骨科的常见病，主要来自于腰椎间盘退行性病变，髓核突出刺激、压迫硬膜囊及相关神经，导致腰腿疼痛和神经功能障碍[1]。多数LDH患者倾向于保守治疗，追踪部分LDH患者发现，腰椎突出组织会逐渐缩小或消失，目前关于LDH突出组织自发性吸收机制尚未完全阐明。随着分子生物学的发展，相关研究显示，在LDH组织自发性吸收过程中，血管化现象与突出组织吸收程度及预后关系密切[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是诱导新生血管形成的常见因子[3-4]，由此推断2者可能参与LDH自发性吸收过程，目前此类研究多在动物模型中开展，在人体中研究较少[5]。本研究以48例LDH患者为研究对象，探究VEGF、bFGF在突出椎间盘中的表达及相互关系，分析其与椎间盘自发性吸收的关系，以期为临床非手术治疗LDH提供新依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年10月—2021年8月行LDH手术取得的腰3～骶1段椎间盘组织48例，作为观察组，纳入标准：(1)标本经后路手术获取;(2)患者符合《腰椎间盘突出症诊疗指南》[6]中关于LDH诊断标准;(3)经影像学检查证实。排除标准：(1)存在心脑血管疾病、肝肾功能严重不足患者;(2)存在腰椎骨折、脊柱结核、脊柱肿瘤肿瘤等患者;(3)行硬膜外腔封闭、化学溶核、经皮髓核切吸术治疗及二次手术者。另选因椎体骨折经手术切开复位治疗所获得的胸9～腰2段正常椎间盘组织8例作为对照，排除椎管手术史、椎间盘突出或组织变性者。根据术中观察后纵韧带是否完整，将获得的椎间盘组织病理类型分为破裂型(后纵韧带破裂)和非破裂型(后纵韧带完整)。观察组中破裂型24例、非破裂型24例。

1.2 研究方法

所获取组织均采用10%甲醛固定，常规梯度浓度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后连续切片，切片厚度4 μm。

1.2.1显微镜观察椎间盘组织结构 采用HE染色，二甲苯脱蜡10 min(2次)，梯度酒精脱水，苏木素染色5 min，流水冲洗，1%盐酸溶液分化30 s，流水冲洗，1%氨水泛蓝30 s，蒸馏水冲洗1 min，伊红染色2 min，流水冲洗，常规脱水、透明、封片、中性树胶封片。由 2 名病理科医生采用LOGENE-Ⅰ医用图像处理系统观察显微镜下椎间盘组织结构，判断是否软骨细胞增生、血管新生、纤维增生及炎细胞浸润等。

1.2.2免疫组织化学法检测椎间盘组织中VEGF和bFGF的表达水平 采用pH 6.0柠檬酸修复液对石蜡切片进行脱蜡及脱水，热抗原修复、血清封闭10 min、加一抗(1∶100)孵育、4 ℃过夜，加入二抗37 ℃孵育30 min、DAB显色、苏木素复染、脱水透明、中性胶封片。VEGF、b-FGF 的表达主要定位于细胞质，表现为棕黄色颗粒状染色，高倍镜下随机选取 5 个>100 个细胞的视野，取平均值。染色强度判定：无染色为0分、淡黄色或仅个别细胞黄至棕黄色为1分、黄至棕黄色为3分、介入两者之间为2分，阳性细胞百分比<5%为0分、5%～25%为1分、25%～50%为2分、50%～75% 为3分、≥75%为4分；两项评分乘积作为VEGF、b-FGF表达程度的判读依据，≤3分为阴性，≥4分为阳性[7]。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 26.0统计软件进行分析。计数资料采用率(%)表示，组内比较采用McNemar检验，组间比较采用χ2检验。bFGF和VEGF表达的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

观察组，男32例、女16例，年龄18～71岁、平均(44.94±13.49)岁，病程(以腰痛开始计算)1～72月、平均(11.98±15.87)月。对照组，男1例、女7例，年龄50～81岁、平均(47.88±10.04)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2 腰椎间盘组织学改变

HE染色结果显示，对照组可见正常腰椎间盘的髓核及纤维环内外层结构，软骨细胞形态规则，基质稀少均匀，未见新生血管形成；观察组可见软骨细胞及纤维增生，基质增多、排列紊乱、炎性细胞浸润，17例见新生血管(图1)。

注：A为对照组软骨细胞形态规则、基质稀少均匀，B为观察组软骨细胞增生、基质增多，C为观察组血管增生。

2.3 VEGF、bFGF阳性表达

免疫组织化学结果显示，对照组腰椎间盘组织中未见VEGF、bFGF阳性表达，观察组腰椎间盘组织中VEGF阳性33例(68.75%)、bFGF阳性41例(85.42%)，VEGF主要在血管内皮细胞、纤维细胞及软骨细胞中表达，bFGF主要在软骨细胞及血管内皮细胞中表达。见图2。

注：A为对照组VEGF未见表达，B为观察组VEGF在软骨细胞中表达，C为观察组bFGF在血管内皮细胞中表达。

2.4 不同病理类型和病程的LDH患者腰椎间盘组织中VEGF和bFGF阳性表达

结果显示，破裂型LDH患者腰椎间盘组织中VEGF阳性总表达率(87.5%)高于非破裂型(50%)，差异有统计学意义(P<0.05)；破裂型和非破裂型LDH患者腰椎间盘组织中bFGF阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同病程中，患者病程>12个月的破裂型LDH腰椎间盘组织中VEGF阳性表达率(75%)高于非破裂型(12.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)；其余病程破裂型和非破裂型LDH腰椎间盘组织中VEGF阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同病程的LDH患者腰椎间盘组织中VEGF和bFGF阳性表达[n(%)]

2.5 LDH患者的腰椎间盘组织中VEGF和bFGF阳性表达的相关性分析

经McNemar检验发现，VEGF阳性灵敏度(31/33=93.94%)高于bFGF阳性灵敏度(31/41=75.61%)，差异有统计学意义(χ2=4.083，P=0.039)。经Spearman秩相关分析发现，LDH患者的腰椎间盘组织中bFGF与VEGF表达呈显著正相关关系(rs=0.358，P=0.012)。

3 讨论

突出椎间盘自发性吸收是LDH患者在未经化学溶核、外科手术干预情况下发生的突出组织自发性消失或缩小现象[8]。随着MRI的广泛应用，国内外有关LDH突出组织自发性吸收的临床报告日益增多，证实自发性吸收现象客观存在，这对手术治疗LDH提出了更为严格的适应证[9-10]。目前关于突出椎间盘自发性吸收的机制越来越明晰，包括新生血管形成、炎症免疫反应、机械压力、细胞自噬与凋亡等多种因素，但具体发生过程及如何激活相关机制仍尚未完全阐明[11]。本研究从新生血管形成因素入手，了解新生血管形成过程中相关因子的表达，以期为优化临床LDH治疗方案提供新的方向。

正常成年椎间盘髓核及纤维环是体内最大的无血管组织，髓核所需营养物质主要经软骨终板和纤维环渗透进入，LDH患者进入硬膜外腔的突出组织表面可见明显的新生毛细血管[12-14]。VEGF作为重要的血管生长刺激因子之一，一方面能促进新生血管形成，将炎性细胞募集到炎症区域，另一方面通过内皮细胞VEGFR-2受体增加血管通透性，维持炎症反应过程，促进巨噬细胞的浸润及吞噬，从而使突出的髓核组织逐渐缩小和消失[15-16]。Pufe 等[17]发现利用 VEGF可刺激软骨细胞，显著上调金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-13 的表达，下调金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2 的表达，促进椎间盘退变；采用VEGFR-2 抑制剂可逆转VEGF 对软骨细胞的促分解代谢反应，缓解退变进程。bFGF也是促进血管形成的重要因子，通过促进血管内皮细胞分裂及诱导大量的纤维蛋白溶酶原激活剂产生，促使新的毛细血管芽形成。研究显示，bFGF在突出的髓核组织中呈高表达，且能与炎症因子肿瘤坏死因子-ɑ相互作用，通过诱导巨噬细胞和提高金属基质蛋白酶的表达促进突出组织的吸收[18]，注射bFGF 能减少退变早期椎间盘形态结构的破坏[19]。

本研究中病理组织学检测对照组未见新生血管形成，观察组17例见新生血管。免疫组织化学检测48例LDH组织VEGF、bFGF阳性率分别为68.75%及85.72%，对照组未见VEGF、bFGF阳性表达，破裂型的VEGF阳性总表达率(87.5%)高于非破裂型(50%，P<0.05)，提示新生血管形成是LDH患者突出组织自发性吸收的重要过程，VEGF、bFGF均参与了突出组织自发性吸收过程，且破裂型更能反映血管新生及自发性吸收特点。此外，有研究显示突出椎间盘组织自发性吸收主要发生在发病后2～12个月，3～6个月时呈显著性变化，巨大破裂型LDH急性起病时更易发生自发性吸收现象[11]。本组研究中病程≤12月破裂型患者VEGF阳性表达率无明显差异，随病程延长到12个月以后VEGF阳性表达率降低，但病程>12个月破裂型患者VEGF阳性表达率(75%)仍高于非破裂型(12.5%，P<0.05)；破裂型和非破裂型患者的bFGF阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，bFGF阳性表达性率在7～12个月时开始降低，提示病程≤12月破裂型患者更易发生突出组织自发性吸收，且随病程延长破裂型患者发生自发性吸收的可能性仍大于非破裂型患者，同时可推测VEGF表达的降低可能与后期血管缺血及闭锁有关；而bFGF在整个重吸收过程变化缓慢，可推测其在椎间盘发育、成熟及退变过程中起持续作用。除此之外，bFGF能作用于血管壁，通过提高VEGF的蛋白水平，促进血管新生[20]。实验相关性分析显示，bFGF和VEGF呈显著正相关关系(r=0.358，P=0.012)，也验证了bFGF能促进VEGF的表达。观察组组织中见炎性细胞浸润、软骨细胞增生、基质增多，可能与炎症反应介导的细胞吞噬、基质金属蛋白酶的合成与降解失衡等相关，具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，破裂型患者病程≤12月更易发生突出组织自发性吸收；VEGF、bFGF均参与了突出椎间盘自发性吸收过程，且bFGF能促进VEGF的表达，了解两者在新生血管形成及突出椎间盘自发性吸收过程中的作用及规律，有望为非手术治疗LDH提供了可靠证据和新的思路。