复合酶对草莓出汁率和澄清度的影响

陈佳楠，冯敏，张超，徐保国*，周存山，马海乐

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏大学食品物理加工研究院，江苏 镇江 212013）

草莓颜色鲜艳、柔软多汁，富含对健康有益的活性成分（维生素、矿物质、酚、类黄酮等），素有“浆果皇后”的美称[1]。新鲜草莓的水分含量达90%以上，且极易腐烂变质，将草莓加工成草莓汁是一种有潜力的草莓深加工形式。

酶处理广泛应用于果汁制造，以提高果汁产量并降低果汁黏度，从而改善管路输送，过滤和包装，从工业和加工角度来看十分重要[2]。此外，酶通常用于浆果类果汁生产，酶处理所得的果汁可以通过离心或过滤得到清汁。澄清后，果汁的澄清度、香气和风味等均增加[3]。酶解技术具有分解果肉细胞物质的能力，不同种类的酶制剂在果汁处理过程中具有特异性作用。常用于果汁加工的酶制剂有果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶等，均可降解形成细胞壁网络的多糖，释放果汁和糖苷结合的化合物[4]。果胶酶是一类水解酶，可催化果胶中α-1，4-糖苷键的裂解，生成聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸等[5]；而纤维素酶催化纤维素链中α-1，4键的水解，产生低聚糖、纤维素二糖和葡萄糖[6]。单一酶加入的酶解效果往往具有局限性，而复合酶之间的协同作用可以弥补这一缺陷[7-9]。因此，本文旨在探究适合草莓酶解的复合酶和酶解条件，以提高草莓的出汁率和澄清度，为开发草莓汁工艺研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红颜草莓（Fragaria×ananassa Duch.）购自江苏省丹阳市草莓农场，选择大小和颜色均匀且无机械损伤的成熟草莓作为试验对象，储存于4℃的冰箱中备用；果胶酶（30 000 U/g）、纤维素酶（10 000 U/g）、木聚糖酶（10 000 U/g）：上海麦克林生物科技有限公司；抗坏血酸：镇江国药集团化学试剂公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WBL2501B型料理机：广东美的生活电器制造有限公司；DL-5C型冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；CPA1003P型电子天平：德国赛多利斯集团；PHS-3C型pH计、WAY-2S型阿贝折光仪：上海精密科学仪器有限公司；DDS-11AT数字电导率仪：上海雷磁新泾仪器有限公司；T6新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 草莓的品质特性测定

在室温（20℃）下，采用pH计测定草莓打浆后的pH值；水分含量参照王旭乐[10]的干燥法；可溶性固形物采用阿贝折光仪进行测定[11]，以白利糖度（°Brix）为单位表示；电导率用电导率仪测定[12]，以ms/cm为单位表示；可滴定酸采用NaOH滴定法测定[13]；还原性糖采用蒽酮-硫酸显色法测定[14]。

1.3.2 草莓汁的制备

取适量的草莓，去除花萼和果梗、洗净表面杂质、沥干并切成小块，按料液比2∶1（g/mL）加水打浆，并加入0.05%抗坏血酸护色，再加入一定量的果胶酶和纤维素酶，搅拌均匀，然后将其放入水浴锅中进行酶解反应，酶解结束后迅速用冷水降到室温（20℃），8 000 r/min离心10 min，上清液经两层纱布过滤，得到草莓汁。

1.3.3 草莓汁出汁率的测定

参照Bora等[15]的方法测定出汁率，计算公式如下。

1.3.4 草莓汁澄清度的测定

在660 nm处测量果汁的透光率，以透光率T（%）表示果汁的澄清度[16]。

1.3.5 酶解单因素试验设计

选择果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶3种不同的酶制剂并且两两复合，在酶解温度25℃、酶解时间30 min，固定酶添加量为0.12%的初始酶解条件基础上，研究酶制剂对草莓汁出汁率和澄清度的影响，找出最适酶制剂进行复合。

分别以复合酶质量比（1∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、2 ∶3、3∶2）、复合酶添加量（0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%）、酶解温度（25、30、35、40、45、50 ℃）、酶解时间（20、25、30、35、40、45 min）进行单因素试验，考察各指标对草莓出汁率和澄清度的影响。

1.3.6 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，选取复合酶添加量（A）、复合酶质量比（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为自变量，以草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）为响应值，设计四因素三水平的响应面优化试验，编码水平见表1。

表1 响应面优化试验因素水平Table 1 Factors and levels in the optimization test by response surface methodology

1.3.7 感官评价

参考GB/T 10221—2021《感官分析 术语》、李雨浩[17]和Laaksonen等[18]的方法，使用九点快感标度法评估草莓汁样品的感官特性。由20名（10男10女）经过培训的评价员，根据草莓汁的感官特征分别从9个感官指标进行评分，每个指标按强度分级，从0～10分进行打分，具体评价标准见表2。

表2 草莓汁的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of strawberry juice

1.4 数据统计和分析

每组试验进行3次，使用SPSS 22.0统计软件，对数据进行统计分析。比较组间的单因素方差和邓肯分析，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。使用Origin 2021作图，描绘各试验数据的变化情况。采用Design-Expert 11软件进行响应面试验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 草莓的品质特性分析

本试验所采用的草莓原料的品质特性分析见表3。

表3 草莓的品质特性Table 3 Quality characteristics of strawberries

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 不同酶制剂对草莓出汁率和澄清度的影响

不同酶制剂对草莓出汁率和澄清度的影响见图1。

图1 不同酶制剂对草莓出汁率和澄清度的影响Fig.1 Effects of different enzyme preparations on strawberry juice yield and clarity

由图1可知，在单一酶中果胶酶的出汁率最高，其次是纤维素酶和木聚糖酶，果胶酶的酶解效果比纤维素酶更好，主要是因为在草莓果肉中，果胶含量比纤维素高。因此，果胶的降解对于从细胞中释放果汁更为重要。复合酶的酶解效果明显高于单一酶解，其中果胶酶和纤维素酶复合后，出汁率最高，从对照组的64.16%提高到87.38%。与对照组相比，果胶酶处理的澄清度显著升高（p＜0.05），其他单一酶的效果并不显著（p＞0.05）。果胶酶和纤维素酶复合的澄清度最高，从对照组的2.34%提高到72.83%。在香蕉汁中，Bora等[15]通过果胶酶和纤维素酶联合处理来改善澄清度。综合考虑不同酶制剂对出汁率和澄清度的影响，最终选择果胶酶和纤维素酶进行复合，以实现对细胞壁化合物的最大分解。

2.2.2 复合酶质量比对草莓出汁率和澄清度的影响

复合酶质量比对草莓出汁率和澄清度的影响见图2。

图2 复合酶比例对草莓出汁率和澄清度的影响Fig.2 Effect of ratio of complex enzymes on strawberry juice yield and clarity

由图2可知，当果胶酶与纤维素酶质量比为3∶1时，草莓出汁率最高，为90.31%。由于果胶酶比纤维素酶在增加草莓出汁率方面更有效，草莓出汁率随着果胶酶占比的增加而呈现先上升后降低的趋势，当果胶酶占比过高时，又不足以破坏草莓细胞壁中的纤维素结构，导致出汁率低。草莓汁的澄清度也随着复合酶质量比的不同而变化，质量比为3∶1时，草莓汁的澄清度为88.39%，显著高于其他复合酶质量比的澄清度（p＜0.05），澄清度主要受果胶的影响较大，因此综合考虑，选取2∶1、3∶1、4∶1为响应面试验的3个水平。

2.2.3 复合酶添加量对草莓出汁率和澄清度的影响

复合酶添加量对草莓出汁率和澄清度的影响见图3。

图3 酶添加量对草莓出汁率和澄清度的影响Fig.3 Effect of enzyme addition amount on strawberry juice yield and clarity

由图3可知，随着复合酶添加量的增加，草莓的出汁率和澄清度先增加后降低。在复合酶添加量为0.16%时，草莓出汁率最高，为89.09%，显著高于其他复合酶添加量（p＜0.05）；当添加量为0.20%时，草莓汁的澄清度达到最大，为90.66%。当复合酶添加量过低时，酶促反应不足，草莓中的果胶无法完全分解，而当复合酶添加量过高时，由于草莓汁的pH值太低，未反应的酶会形成酶蛋白沉淀[19]，这些都会导致草莓出汁率低、澄清度差。因此选取0.12%、0.16%、0.20%为响应面试验的3个水平。

2.2.4 酶解温度对草莓出汁率和澄清度的影响

酶解温度对草莓出汁率和澄清度的影响见图4。

图4 酶解温度对草莓出汁率和澄清度的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on strawberry juice yield and clarity

由图4可知，在酶解温度为25℃～45℃时，草莓的出汁率随着酶解温度的升高而显著上升（p＜0.05），当温度达到45℃后出汁率开始下降，45℃时出汁率为最高值90.51%。可见温度对酶活性有一定影响，温度过低或过高均会影响酶活力，从而导致酶解能力下降。酶解温度为30℃时，澄清度最高，为78.88%。随后呈缓慢下降的趋势，这与温度升高导致的草莓可溶性固形物含量增加有密切关系，而且温度升高会引起絮凝沉淀物的部分重新溶解[20]，从而透光率降低。综合考虑草莓汁在较高温度下酶解，会影响草莓品质，因此选择35、40、45℃为响应面试验的3个水平。

2.2.5 酶解时间对草莓出汁率和澄清度的影响

酶解时间对草莓出汁率和澄清度的影响见图5。

图5 酶解时间对草莓出汁率和澄清度的影响Fig.5 Effect of enzymolysis time on strawberry juice yield and clarity

由图5可知，20 min～35 min时，随着酶解时间的延长，草莓出汁率迅速升高，35 min后逐渐趋于平稳并逐渐下降。酶解35 min时，草莓出汁率最高，为89.66%。但在 35 min～40 min 时，出汁率无显著变化（p＞0.05）。草莓的澄清度呈先降低后升高又降低的趋势，所以酶解时间过长会造成草莓澄清度降低，营养成分也可能损失。综合考虑草莓汁的酶解时间越长，越容易造成氧化褐变，因此选择20、30、40 min为响应面试验的3个水平。

2.3 草莓酶解工艺优化试验结果与分析

2.3.1 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，选取复合酶添加量、复合酶质量比、酶解温度、酶解时间为自变量，以草莓出汁率和澄清度为响应值，设计四因素三水平的响应面优化试验，试验结果见表4。

表4 响应面试验设计与结果Table 4 Design and results for response surface methodology

续表4 响应面试验设计与结果Continue table 4 Design and results for response surface methodology

应用Design-Expert 11软件进行数据分析，得到草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）与复合酶添加量（A）、复合酶质量比（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）之间的二次多项式回归方程如下。

2.3.2 响应面方差分析

对草莓出汁率和澄清度的方差分析结果见表5和表6。

表5 草莓出汁率的方差分析结果Table 5 Variance analysis results of strawberry juice yield

表6 草莓汁澄清度的方差分析结果Table 6 Variance analysis results of strawberry juice clarity

由表5和表6可知，两个模型的p＜0.000 1，说明回归方程极显著，失拟项的p＞0.05表明差异不显著，说明模型拟合度较好，试验误差较小。由方差分析p结果可知，在影响草莓出汁率的各项因素中，B、CD、B2对草莓出汁率的影响显著；A、C、D、AD、A2、C2、D2对草莓出汁率的影响极显著；其余因素均对草莓出汁率不显著。在影响草莓汁澄清度的各项因素中，A、BC对草莓汁澄清度的影响显著；B、C、D、BD、CD、A2、B2、C2、D2对草莓汁澄清度的影响极显著；其余因素均对草莓汁澄清度不显著。根据F值的大小得出各因素对出汁率的影响顺序为酶解温度＞酶解时间＞复合酶添加量＞复合酶质量比，对澄清度的影响顺序为酶解时间＞复合酶质量比＞酶解温度＞复合酶添加量。

2.3.3 响应曲面分析

各因素之间的交互作用对草莓出汁率和澄清度的等高线图和三维响应面图见图6和图7。

图6 各因素对草莓出汁率交互作用的等高线图和三维响应面图Fig.6 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice yield

图7 各因素对草莓澄清度交互作用的等高线图和三维响应面图Fig.7 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice clarity

从图6和图7中的椭圆形状可以看出各因素交互作用的强弱，越接近椭圆表示交互作用越显著，若呈现圆形则交互作用不显著；三维响应面图的坡度越陡峭，说明因素对响应值的影响越大[21]。综合各因素对草莓出汁率和澄清度的综合影响，通过软件分析对两个回归方程进行极大值求解，得到最佳酶解条件为复合酶添加量为0.17%、复合酶质量比为3.27∶1、酶解温度为41.03℃、酶解时间为34.02 min，此条件下草莓出汁率的预测值为90.72%，澄清度的预测值为84.79%。根据实际情况，将酶解条件修正为复合酶添加量0.17%、复合酶质量比3∶1、酶解温度41℃、酶解时间35 min。

2.3.4 结果优化与验证

为验证模型预测值的准确性，在上述优化条件下进行3次平行试验，所得草莓出汁率为（90.84±0.45）%，澄清度为（84.61±0.63）%，试验结果与模型方程的理论值基本吻合，进一步证明模型的可靠性。

2.4 感官评价分析

4种不同酶酶解的草莓汁的感官评分见表7。

表7 草莓汁的感官评分Table 7 Sensory scores of strawberry juice

由表7可知，未经酶处理（对照组）的草莓汁与酶处理组有很大不同，对照组的草莓汁澄清度较差、酸味较大、苦味较小、风味较弱。果汁具有大部分的酸和甜的特性，而涩味主要是来自果皮部分和大量的酚类化合物，果胶能结合多酚类物质，从而降低对涩味的感知[22]，所以果胶酶的加入可能同时增加涩味。还有研究发现酶处理是果汁香气改变的主要原因，而短期热处理不会影响果汁气味[23]。在本研究中，不同酶酶解的草莓汁的涩味和气味无显著差异（p＞0.05）。与对照组相比，不同酶酶解的草莓汁的综合评分呈现显著性差异（p＜0.05），综合来看，纤维素酶酶解后具备较好的甜味，果胶酶酶解后色泽、澄清度更高，涩味、气味没有显著性差异，复合酶综合了两种酶的优点，综合评分相对最高，为7.36±1.12，整体风味及口感更优。

3 结论

本研究通过单因素试验确定了草莓汁酶解工艺中复合酶的种类，与单一的酶制剂相比，复合酶明显提高了草莓的出汁率和澄清度，通过响应面优化，确定复合酶最佳酶解条件为复合酶添加量为0.17%、复合酶（果胶酶与纤维素酶）质量比为3∶1、酶解温度为41℃、酶解时间为35 min，此条件下草莓出汁率为90.84%，澄清度为84.61%。与优化前相比，出汁率和澄清度分别提高了6.93%和32.20%。使用九点快感标度法评估草莓汁的感官特性，结果表明复合酶的感官评分最高，整体风味及口感更优。