干热处理对杏鲍菇蛋白质功能和结构的影响

陈怡静，李萍，康雨薇，高璐，王琨，崔桂友*，许慧卿*

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.江苏旅游职业学院烹饪科技学院，江苏 扬州 225500；3.江苏康能生物工程股份有限公司，江苏 仪征 211413）

杏鲍菇是一种药食两用的食用菌品种，具有独特的茎、宜人的香气和良好的烹饪品质。此外，杏鲍菇还含有大量的生物活性物质，如蛋白质、多糖、膳食纤维等，均具有潜在的生物活性功能。

热处理在食品加工行业中广泛用于促进食品的功能性质。干热处理是热处理的一种，是对食品进行物理改性的一种方法，它以空气为介质，通过提高介质的温度使物质内部温度升高，从而使食物表面和内部达到相同温度。在干热加热过程中，蛋白质在高温、低水分条件下，通过影响蛋白质分子的化学键，特别是疏水键，引起蛋白质分子的重新排列，从而导致蛋白质结构和功能特性的变化，如蛋白质变性、蛋白质聚合物的形成、挥发性风味物质的产生等。

目前对蛋白质高温变性的研究大多是在湿热条件下进行的。张雪飞通过研究湿热诱导对聚乳清蛋白的影响，发现巯基随着温度的变化而减少。刘芳等在研究碱与热处理对大米蛋白质结构和功能的影响时，发现随着温度的升高蛋白质结构发生改变，溶解性无明显变化，但乳化性和稳定性在90℃时均达到最大。近年来对杏鲍菇的研究多集中在杏鲍菇多糖的提取或以杏鲍菇为原料进行产品创新，对杏鲍菇蛋白质的研究相对较少，特别是以干热作为加热处理方式的相关研究更为少见。本文旨在研究不同干热温度对杏鲍菇蛋白质结构和功能的影响，从杏鲍菇蛋白质的结构、理化性质和功能特性等方面研究干热处理对杏鲍菇蛋白质的作用机理，以拓宽干热处理杏鲍菇蛋白质在多种食品中的应用，为其开发新型工业化成品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜杏鲍菇：市售；磷酸盐缓冲液：上海博微生物科技有限公司；Tris-甘氨酸（Gly）缓冲液：福晨（天津）化学试剂有限公司；尿素：天津市科密欧化学试剂有限公司；5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：国药集团化学试剂有限公司；β-巯基乙醇：慧兴生化试剂有限公司；双缩脲试剂：广州和为医药科技有限公司；Ellman’s试剂：安徽酷尔生物工程有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：西亚化学科技（山东）有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

S-4800场发射扫描电子显微镜：日本日立公司；J-810圆二色光谱仪：日本JASCO公司；UV-1800紫外分光光度计：上海棱光有限公司；FSH2A可调高速均质机：上海索廷智能设备股份有限公司；BDW1-FW-200高速粉碎机：北京中西华大科技有限公司；SHZ-C水浴振荡器：北京海天友诚科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将新鲜杏鲍菇切片，45℃烘干12h。杏鲍菇经高速粉碎机粉碎后，过80目筛，置于密封容器中保存备用。

1.3.2 杏鲍菇蛋白的分离

将粒度均匀的杏鲍菇粉与去离子水按1∶15（g/mL）混合，参照柳芬芳等的方法提取杏鲍菇蛋白质。将溶液用NaOH调pH值至12，连续振荡2.5 h后，4 000×g离心20 min。用HCl将pH值调至3.6，于4℃冰箱中静置1h，直至出现沉淀。将溶液于中4 000×g离心10 min，取沉淀调节pH值至中性。经冷冻干燥后4℃冷藏备用。

1.3.3 杏鲍菇分离蛋白的干热处理

将 1.3.2得到的蛋白粉在 65、80、95、110、125 ℃下干热处理30 min，冷却至25℃，放入真空袋中保存备用，并以未干热处理的杏鲍菇蛋白粉（即生样）为对照。

1.3.4 杏鲍菇蛋白质理化性质的测定

1.3.4.1 巯基的测定

参考Ellman和Benesch的方法并稍作修改，测定不同杏鲍菇蛋白质处理组的巯基（sulfhydryl group，SH）。称取杏鲍菇分离蛋白用8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素缓冲液配制成0.6%的蛋白溶液。摇匀后取溶液测定游离巯基和总巯基的含量。同时，将牛血清蛋白配制成 0、2、4、6、8、10 mg/mL 蛋白溶液，与双缩脲试剂混合均匀后静置反应10 min，用紫外分光光度计测量540 nm下的OD值，得到标准曲线方程：y=0.042 5x+0.001 5。以同样方法测量其样品蛋白在540 nm下的OD值，根据标准曲线计算蛋白浓度，记为C（mg/mL）。

游离巯基含量的测定：取蛋白溶液加入4%、4 mg/mL DTNB溶液，混合振荡5 min，在412 nm波长下测吸光值记为A。

总巯基含量的测定：取蛋白溶液，加入0.2%β-巯基乙醇溶液，振荡混匀2 h，以体积比1∶2加入12%TCA溶液，静置1 h后，10 000×g离心10 min，弃上清液，取一定体积8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素缓冲液溶解沉淀，再加入Ellman’s试剂，然后用紫外分光光度计在波长412 nm下测定吸光值。

式中：73.53为埃尔曼试剂的摩尔消光系数。

1.3.4.2 溶解度的测定

参考Lee等的方法测定杏鲍菇分离蛋白的溶解度。配制0.4%的蛋白溶液，恒温振荡10 min，离心15 min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定离心前后样品中的蛋白质含量。杏鲍菇分离蛋白的溶解度计算公式如下。

1.3.4.3 发泡能力和发泡稳定性的测定

参考Oboroceanu等的方法测定杏鲍菇蛋白质的发泡能力及其稳定性。取50 mL杏鲍菇蛋白溶液（1%）用匀质机在10 000 r/min、25℃下均质2 min。通过比较0 min时的泡沫体积与样品的初始液体体积来测定发泡能力。发泡稳定性是比较10 min和20 min的泡沫体积与样品的初始泡沫体积。计算公式如下。

式中：V为 0 min 时的泡沫体积，mL；V为 10 min和20 min时的泡沫体积，mL。

1.3.4.4 微观结构

形态特征：采用扫描电镜分别对各组杏鲍菇分离蛋白的形态特征进行观察。取样品粘贴到样品台上，进行喷金镀膜处理，放入扫描电镜抽真空，在10 kV的电压下，调整束斑尺寸，聚集清晰后，拍摄样品的形态结构图像。

圆二色性光谱：采用圆二色谱法对杏鲍菇蛋白进行二级结构分析。参考Chandrapala等的试验方法，配制浓度为0.5 mg/mL的蛋白溶液，在连续充氮的条件下测定其二级结构。

光谱分析条件：远紫外区域为163 nm～280 nm，扫描速度为10 nm/min，光谱间隔0.1 nm，每个样品进行3次扫描，取其平均值。

紫外光谱分析：用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）配制浓度为1 mg/mL的杏鲍菇分离蛋白溶液，在紫外分光光度计下进行扫描，扫描波长为190 nm～300 nm。

1.3.5 数据统计分析

本研究所有试验数据采用SPSS16.0软件进行邓肯多重范围检验（Duncan's multiple range tes，DMRT）分析，采用Origin 2018 64Bit作图。不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。所有数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 巯基检测结果

不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白质巯基含量的影响见表1。

表1 不同干热处理温度对巯基含量的影响Table 1 Effect of different dry heat treatment temperature on the sulfhydryl group content of Pleurotus eryngei protein

由表1可知，生样的杏鲍菇蛋白总巯基含量为84.54 μmol/g 蛋白，游离巯基含量为 21.49 μmol/g蛋白。总巯基和游离巯基的含量均随干热温度的升高而降低。在125℃时，均最低，分别为39.05 μmol/g蛋白和18.01μmol/g蛋白。干热处理组中总巯基含量和游离巯基含量均显著低于对照组（p＜0.05）。随着干热处理温度的升高，蛋白质的高级结构展开，暴露出内部巯基，加速了巯基向二硫键的转变，使所测得巯基含量逐渐下降。赵谋明等观察到鸡肉蛋白中的巯基含量随着热处理温度的升高而逐渐降低，与本研究结果相似。

2.2 溶解度测定结果

蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-水相互作用影响溶解度。杏鲍菇蛋白质的溶解度分布如图1所示。

图1 不同干热处理温度对溶解度的影响Fig.1 Effect of different dry heat treatment temperatures on solubility

由图1可知，随着干热处理温度的升高，杏鲍菇蛋白质的溶解度也逐渐增加，到110℃时达到最大值（0.90±0.03）%，然后在125℃时迅速下降，显著低于其他处理（p＜0.05），且明显看出有少量沉淀生成。产生这种现象的原因可能是蛋白质经过干热处理后，以聚集体的形式存在，蛋白质重新组合，导致溶解度急剧下降。这一现象与黄友如等的研究结果相似。Sun等在研究热处理对玉米醇溶蛋白的影响中也证实了这一变化趋势，说明这种现象的发生并不偶然。

2.3 发泡能力和发泡稳定性测定结果

不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白发泡能力和发泡稳定性的影响见表2。

表2 不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白发泡性能的影响Table 2 Effect of different dry heat treatment temperatures on foaming properties of Pleurotus eryngii protein

由表2可知，杏鲍菇蛋白质的发泡能力随温度的升高在95℃时达到最大值（83.23%），95℃之前随着温度的升高而升高，95℃之后逐渐下降。除125℃处理组外，其余干热处理组的发泡能力均显著高于生样。干热处理后杏鲍菇蛋白的发泡稳定性的变化趋势与发泡能力正好相反。发泡稳定性在95℃时最低（52.86%），然后随温度的升高逐渐增加。干热处理20 min后的发泡稳定性略低于处理10 min的样品。适当热处理使蛋白质分子解聚，分子柔韧性增加，导致吸附在界面上的蛋白质数量增加，气泡膨胀增大，有利于气泡的改善。但随着干热处理温度的升高，蛋白质发生聚合，其溶解度降低，蛋白质不易在空气和水界面上吸附，其发泡能力和发泡稳定性降低。夏珂在研究热处理对荞麦蛋白的影响时发现，干热处理使蛋白质的起泡性出现先升高后下降的现象，但出现最大值时的温度与本试验不一致，产生这种差异可能由于蛋白质的来源不同。

2.4 微观结构

2.4.1 形态特征

图2为杏鲍菇蛋白在扫描电镜（4.05 cm×4.80 cm）下的微观结构。

图2 不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白质形态特征的影响Fig.2 Effect of different dry heat treatment temperature on morphological（SEM）characteristics of Pleurotus eryngii protein

由图2可以看出，未经干热处理的杏鲍菇蛋白质的结构和外观光滑，没有裂纹和孔洞。经过干热处理后，蛋白质表面出现了裂纹和多孔结构，特别是110℃时，杏鲍菇蛋白颗粒表面孔洞数量明显多于其他处理，细小的裂纹也较多。本试验的结果与陈世超观察到的热处理后蛋白质中的裂纹和孔隙相似。Mir等对藜麦分离蛋白（quinoa protein isolates，QPIs）进行热处理后也观察到这种现象。马丹等也证实了大豆分离蛋白因热处理而出现开裂和多孔结构。

2.4.2 圆二色性光谱

在蛋白质或多肽的二级结构中肽键是高度有规律排列的，根据其肽键排列的不同，二级结构不同的蛋白质或多肽，所产生的圆二色谱的谱带位置、峰的强弱均不同。因此，根据所测得的蛋白质或多肽的圆二色性光谱（circular dichroism spectrum，CDS），能反映出蛋白质或多肽链的二级结构位置。杏鲍菇蛋白的圆二色谱见图3。

图3 不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白圆二色谱的影响Fig.3 Effect of different dry heat treatment temperatures on circular dichroism spectra of Pleurotus eryngei protein

由图3可知，未经干热处理的杏鲍菇蛋白的CD谱在208 nm处有明显的负峰，在195 nm处有正峰，说明存在α-螺旋构象的特征。随着温度的升高，65℃和80℃时，208 nm和222 nm处的负峰增强，意味着α-螺旋的百分比增加。温度超过80℃以后，随着温度的升高，208 nm和222 nm处的负峰明显减弱。同时，80℃时杏鲍菇蛋白在216 nm时具有最强的正峰，说明β-折叠所占的比例最低。在220 nm附近处有一正峰，表明该蛋白中含有无规卷曲结构，在110℃时正峰最不明显，说明此温度下蛋白质的无规卷曲结构所占的比例最低。加热后的杏鲍菇蛋白谱线在208 nm处向长波长方向移动，即发生红移。由于发色团吸收光谱发生位移主要取决于它的微环境更加亲水或疏水的结果，因此红移的发生说明体系的亲水性增加，疏水性下降。此现象与上述测得的疏水性在110℃时发生下降的现象相符，出现该现象的原因或许是蛋白质分子发生无规则聚集形成较大的分子，而使疏水基团聚集在大分子内部，隐藏了疏水性位点。而低于100℃时，随着温度的升高，疏水性逐渐升高的现象，或许是由于蛋白质分子得以展开，α-螺旋结构所占的比例较高，增大了疏水性位点的暴露。在100℃的范围内本研究现象与Miyazawa对藜麦分离蛋白进行热处理观察到的结果相似，但其对100℃以上的加热温度并未进行研究。

2.4.3 紫外光谱分析

采用紫外分光光度法分析热处理对杏鲍菇蛋结构的影响。由于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、硫氨酸、半胱氨酸和肽键对紫外线的吸收，使蛋白质可以在280nm左右处出现吸收峰。不同处理组杏鲍菇蛋白质的紫外光谱见图4。

图4 不同干热处理温度对杏鲍菇蛋白紫外光谱图的影响Fig.4 Effect of different dry heat treatment temperature on UV spectrum pattern of Pleurotus eryngii protein

由图4可知，在80℃时吸收峰最大，说明在80℃时暴露的氨基酸和肽键数量最大，在95℃和125℃时其紫外吸收强度出现了低于未处理蛋白的吸收强度。出现该现象的原因可能是因为热处理使蛋白质发生变性，使其三级结构得以展开，内部基团得以暴露，随着温度的进一步升高，在95℃时紫外强度发生下降，这种转变或许是由于展开的蛋白质小分子进一步发生聚集，使功能基团被包裹在内部。何兴芬研究热处理对藜麦蛋白三级结构的影响时发现随着温度的升高和时间的延长，在121℃、30 min时其紫外吸收强度达到最低值，与本研究所得结果相似。

3 结论

通过研究发现，不同干热处理温度可以影响杏鲍菇蛋白质的结构，结构的改变对蛋白质功能有不同的影响。95℃处理30 min，蛋白质的大部分功能特性均能得到改善，但温度的升高对杏鲍菇蛋白质二级结构的破坏逐渐增加，当温度达到125℃时，蛋白质的功能特性普遍不如未处理的杏鲍菇蛋白质。杏鲍菇蛋白质干热处理后结构和功能特性的变化为进一步研究干热处理对杏鲍菇蛋白质加工特性的影响提供了参考。