基于网络药理学探讨“杜仲-牛膝”治疗腰椎间盘突出症的分子机制

邓梦 马斌祥 关永林▲ 张洋 常斌 姚鹏程 刘静怡

腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）是骨科临床的一种常见疾病，是由椎间盘退变、突出、压迫或刺激临近组织或相应平面的神经根、马尾神经后表现出来的一种综合征[1]，主要以下腰部疼痛及坐骨神经放射痛为临床表现，严重时可出现马尾神经损伤症状，是临床下腰痛的主要病因。腰椎间盘突出症归属于中医学“腰痛”“痹病”范畴，主要病位在肾、肝等，主要病性是血瘀、湿、寒、气滞等[2]，主要治疗方法是补益肝肾、强筋骨等。秦晓宽等[3]研究表明，“杜仲-牛膝”在LDH 的治疗中较为常见，杜仲、牛膝均可归肝、肾经，功效能补肝肾、强筋骨。骨伤科治疗LDH 的常用方剂如独活寄生汤、杜仲腰痛丸等均含有“杜仲-牛膝”，且疗效显著。既往研究多从杜仲、牛膝单味中药或该药物组成的复方治疗LDH着手，目前药对联合治疗LDH的研究较少。

网络药理学是近年来新兴的基于系统生物学，利用计算机进行生物网络分析，构建“药材-成分-靶标”网络，分析通路机制的一门学科，其为药物治疗疾病从靶点分子层面提供了导向。本文利用网络药理学的相关原理和方法，探讨“杜仲-牛膝”治疗LDH 的分子机制，为进一步实验研究及临床应用提供思路[4-5]。

1 资料和方法

1.1 “杜仲-牛膝”有效成分及靶点预测通过检索中药系统药理学数据库TCMSP[6]（https://tcmsp-e.com）挖掘“杜仲-牛膝”的有效成分，根据成分毒药物动力学（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）参数对药物潜在活血成分进行筛选，将药物口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、药物相似度（drug likeness,DL）≥0.18定义为筛选条件[7]。

1.2 “杜仲-牛膝”有效成分作用靶点预测及网络构建通过TCMSP 及PharmMapper 数据库（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）[8-10]预测“杜仲-牛膝”有效成分的作用靶点，利用Uniprot 数据库[11]（https://www.

uniprot.org）完成靶点基因名称（Gene name）的标准转换。使用网络可视化软件Cytoscape 3.7.1对筛选出的“杜仲-牛膝”有效成分及作用靶点进行网络构建，用节点（node）表示药物、有效成分及靶蛋白，用边（edge）表示作用关系，利用软件中network analyzer 插件进行网络特征分析，以明确“杜仲-牛膝”中有效分与靶点之间的相互作用关系。

1.3 LDH 疾病相关靶点获取通过OMIM（https://omim.org）、DrugBank[12]（https://go.drugbank.com/）、GeneCards（https://www.genecards.org）等疾病数据库，以“Lumbar disc herniation”及“LDH”为关键词对已知LDH 相关靶点进行检索，检索截止时间为2021 年11月，删除重复值，得到已知的LDH疾病相关靶点。

1.4 “杜仲-牛膝”治疗LDH的网络构建及分析通过Venny分析获得药物与疾病共同作用的靶点，绘制韦恩图，将获得的中药有效成分、药物与疾病作用靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，构建“有效成分-靶点-疾病”的可视化网络图。

1.5 靶点蛋白与蛋白互作（PPI）网络分析将初步得到的潜在作用靶点输入STRING 数据库[13]（https：//string-db.org）,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）;将STRING数据库获得的数据文件导入Cytoscape 3.7.1，通过软件的数据分析功能分析PPI网络中各个节点的节点度值（Dgree），用节点颜色和大小代表节点度值，Dgree值越大代表其在相互作用网络中作用越重要。将Dgree值前10位定义为“杜仲-牛膝”治疗LDH的关键靶点。

1.6 生物富集分析利用DAVID[14]（https://david.ncifcrf.gov/）数据库对“杜仲-牛膝”有效成分作用靶点与LDH 疾病靶点的交集进行靶点基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析，设定（P＜0.05）分析主要生物过程及涉及的主要信号通路。

2 结果

2.1 “杜仲-牛膝”药物有效成分及编码通过TCMSP数据库挖掘杜仲及牛膝的药物有效成分，获得“杜仲-牛膝”潜在有效成分。根据ADME参数筛选标准，设置OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，结果：牛膝有效成分共176 个，符合条件的有20 个；杜仲有效成分共147 个，符合条件的有28 个；其中两药共同有效成分有3个。见表1。

表1 “杜仲-牛膝”药物有效成分及编码

续表

2.2 “杜仲-牛膝”有效成分作用靶点预测及网络构建通过TCMSP 及PharmMapper 数据库预测所筛选出的“杜仲-牛膝”有效成分的作用靶点，利用Uniprot数据库进行靶点基因名称（Gene name）的标准转换，得到杜仲有效成分作用靶点共260个，牛膝作用靶点共238 个，其中两种药物的共同作用靶点211 个。利用网络可视化软件Cytoscape 3.7.1 进行“杜仲-牛膝”有效成分及作用靶点的网络构建，利用软件中的network analyzer 插件进行网络特征分析，以明确“杜仲-牛膝”中有效成分与作用靶点的相互作用关系，用节点（node）表示药物、有效成分及靶蛋白，用边（edge）表示其中的作用关系，节点（node）共334个，作用关系边（edge）共1164条，见图1。

图1 “杜仲-牛膝”有效成分-作用靶点网络图

2.3 “杜仲-牛膝”治疗LDH疾病作用靶点预测通过对OMIM、DrugBank、GeneCards 等疾病数据库进行筛选，合并去重后通过Uniprot 数据库完成靶点基因名称（Gene name）的标准转换，得到目前已知LDH 疾病靶点506个。利用Venny 分析绘制Venny 图获得药物与疾病共同作用的靶点，得到药物与疾病交集62个，代表“杜仲-牛膝”治疗LDH 的潜在靶点数量62个，同时通过Cytoscape 3.7.1 进行药物-疾病-靶点的可视化分析，见图2、图3。

图2 药物-疾病-靶点韦恩图

图3 药物-有效成分-疾病-靶点网络图

2.4 PPI 网络结果分析将所得到的“杜仲-牛膝”治疗LDH潜在靶点通过STRING数据库进行PPI分析（DDX6与其他靶点蛋白均未关联，故将其移除），见图4。将获得的结果利用Cytoscape 3.7.1 中network analyzer插件对潜在靶点PPI进行网络特征分析，共有61 个靶点，1034 个作用关系。其中关联度最高的前10 种靶蛋白为IL6、TNF、IL1B、ALB、FN1、MMP9、AKT1、JUN、PTGS2、TP53，认为这是治疗疾病的核心靶点，见图5。

图4 “杜仲-牛膝”治疗LDH的PPI网络图

图5 药物治疗疾病的PPI网络图

2.5 生物富集分析将药物治疗疾病的潜在靶点导入DAVID 数据库，进行GO 富集分析，得到生物学进程（Biological Process，BP）366 条，细胞组分（Cellular Component，CC）36 条，分子功能（Molecular Function，MF）71 条。靶点主要参与RNA 聚合酶II 启动子转录正调控、参与炎症反应、调节细胞增殖和细胞凋亡、免疫应答、脂多糖应答反应、调节血管生成及对缺氧反应等生物学进程，主要在胞外空间、细胞核线粒体等区域发挥作用，主要参与蛋白质、酶和转录因子的结合、细胞因子及蛋白质二聚化活性等MF。见图6。

图6 GO富集分析气泡图

潜在靶点KEGG富集分析得到100条相关信号通路，药物-疾病共同靶点主要参与：类风湿性关节炎、结直肠癌、癌症中的蛋白多糖、癌症中的途径、HTLVI感染、甲型流感、乙型肝炎、结核、阿米巴病、弓形虫、恰加斯病（美国锥虫病）、利什曼病、百日咳、沙门氏菌感染、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、破骨细胞分化、PI3K Akt 信号通路、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、MAPK信号通路。见图7。

图7 KEGG富集分析

将筛选得到的“杜仲-牛膝”有效成分及药物与LDH的共同作用靶点和靶点参与数量前20的信号通路导入Cytoscape 3.7.1 进行可视化分析，同时利用软件内数据分析插件进行网络特征分析，节点颜色及大小反映重要程度，得到节点共119 个，相互作用关系623条。见图8。

图8 成分-疾病-靶点-信号通路网络图

3 讨论

腰椎间盘突出症归属于中医学“腰痛”“痹病”的范畴，西医对症治疗的不良反应较多，而疾病早期及时的中医药干预能有效改善症状，减轻患者心理及身体负担，改善生活质量。其中杜仲-牛膝作为治疗LDH的常用药对，临床使用频率高且疗效显著。本文基于网络药理学的相关理论及技术，研究了“杜仲-牛膝”联合治疗LDH的分子作用机制。

通过筛选得到“杜仲-牛膝”有效成分共45种，有效成分作用靶点共287个，其中治疗LDH的潜在靶点62 个。根据构建的“药物-疾病-靶点-信号通路”网络图，杜仲-牛膝治疗LDH 的主要作用成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（aempferol）、汉黄芩素、β-胡萝卜素、去氢双丁香酚等。现代药理学研究表明，槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节等药理活性，能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，增强小鼠免疫功能，又能抑制其T、B 细胞的增殖，抑制TNF-α、IL-6、INF-γ等促炎因子的分泌[15]，主要通过调控PI3K/AKT、NFκB 等信号通路抑制细胞炎症过程[16]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗癌、免疫调节等药理作用。蔡美云等[17]研究表明，山奈酚能通过已知p38 MAPK 小号通路的激活进而发挥抗炎和神经保护作用。邹雪莲等[18]研究表明，山奈酚作为Nrf2 激活剂参与氧化应激反应，提高细胞对氧化损伤的保护作用。基础研究发现，汉黄芩素可通过调节MLCK/MLC、NF-kB、Nrf2、Hif-1α、ERK 和STAT3 等相关信号通路途径，进而发挥抗炎、抗氧化、免疫调节等作用[19]。β-胡萝卜素是维生素A的前体，具有抗氧化、增强机体免疫、调节炎症反应、预防癌症等功能[20]，其主要通过调节NF-κB、JAKSTAT 等信号通路发挥作用。去氢双丁香酚具有抗炎、抗氧化作用，能影响MAPK-JNK/MAPK、VAChT和STAT3 等信号通路，降低IL-6、IL-1β 等炎症因子，以及具有DPPH 自由基清除活性，并减少LPS 刺激细胞释放的NO，进而发挥抗氧化作用[21-22]。

药物-疾病共同靶点PPI网络图结果中，Degree值前10分别为IL6、TNF、IL1B、ALB、FN1、MMP9、AKT1、JUN、PTGS2、TP53。白细胞介素（interleukin，IL）能通过影响基质金属蛋白酶（MMPs）及抑制MMPs 中的蛋白多糖合成而作用于椎间盘[23]。其中IL-6 是反映炎症程度的重要指标，促进巨噬细胞和淋巴细胞分泌炎性因子，通过干预基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的活性影响椎间盘生物功能；IL-1β 能通过干预NF-KB/p65信号通路，调节人体髓核细胞中聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达[24]。TNF-α 通过促进炎症因子的释放，同时增加血管通透性，促进破骨细胞增殖，导致软骨细胞凋亡，从而引起椎间盘退变[25-26]。ALB作为维持机体营养和渗透压的重要蛋白质，既可以用于评估营养状态，也能用于区分炎症反应程度[27]。FN1 能干预VEGF、PI-3K/Akt2 等信号通路，参与细胞黏附、细胞骨架蛋白的调节[28]。AKT1 主要调节细胞凋亡、血管损伤。MMP9 主要通过调节细胞外基质降解，参与椎间盘退变进程。“杜仲-牛膝”药物治疗LDH疾病的关键靶点蛋白主要参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、调节血管通透性等生物过程。

生物富集分析结果显示，“杜仲-牛膝”治疗LDH主要涉及的信号通路包括TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、破骨细胞分化、PI3K-Akt 信号通路、MAPK信号通路等，主要涉及细胞分化和凋亡、炎症反应相关及代谢（如内分泌、氧化应激等）等相关生物学进程。TNF（肿瘤坏死因子）主要引起细胞凋亡，目前主要研究的有TNF-α 和TNF-β 两大类，TNF 相关信号通路主要参与细胞凋亡、调节机体免疫及炎症反应等进程，椎间盘中髓核细胞产生的TNF-α是引起椎间盘退变的主要炎性物质之一，其作用主要表现在可增加椎间盘细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）的有效表达，并使基质中的蛋白多糖、弹性蛋白及胶原等大量减少[5]。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）相关信号通路主要与免疫应答相关，调节炎症反应。TLRs 的激活既可诱导先天性炎症反应，也可激活抗原适应性免疫应答反应。目前研究已证明，活化TLRs 信号传导途径主要有两条：一种是由MyD88衔接蛋白介导的MyD88依赖性信号转导通路，最终诱导炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和趋化因子的基因表达和释放；另外一种是MyD88 非依赖性信号转导通路，最终促进抗炎因子如IFN-α、IFN-β、IL-10 和TGF-β 等的释放[29-30]。破骨细胞分化主要与OPG/RANKL/RANK、NFkB、c-src-PI3K-Akt、MAPK、CN/NFAT、IDO/Tryptophan 等相关信号通路相关[31]。PI3K-Akt信号通路一直以来作为研究热点，主要参与细胞凋亡、调节炎症及氧化应激反应[32]。MAPK信号通路主要包含细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK等，参与调节机体炎症、细胞增殖分化及细胞凋亡等生物过程[33]。

本文通过网络药理学分析，发现“杜仲-牛膝”通过多成分、多靶点、多通路发挥抗炎、抗氧化、调节细胞增殖分化及细胞凋亡的药理作用治疗LDH，从靶点分子层面为药物作用于疾病提供了参考。此次研究既分析了“杜仲-牛膝”的主要成分及作用靶点，为进一步研究药物治疗不同疾病做基础；同时分析了LDH疾病的相关靶点基因，可进一步研究疾病的相关信号通路，基于信号通路挖掘相关治疗药物，同时两者结合，为杜仲-牛膝治疗LDH 进一步的实验研究及临床应用提供参考思路。