地塞米松通过Wnt/β-catenin信号轴对颈椎病大鼠模型椎间盘纤维环细胞凋亡的影响

姜伟，陈东荣，李琳

(1.滁州市中西医结合医院，安徽滁州 239000；2.滁州市第一人民医院，安徽滁州 239000)

颈椎病是一种与年龄密切相关的颈椎退行性疾病[1]，在我国患病率高达17.3%[2]。但是目前有关颈椎病的发病机理以及特异性药物治疗的相关研究仍较为缺乏。既往研究显示，椎间盘细胞凋亡指数增加、细胞外基质降解失衡以及生物学的改变等是椎间盘退变过程中的主要事件，其中椎间盘细胞凋亡或因为细胞凋亡而导致的细胞外基质代谢紊乱是椎间盘退变的重要因素[3-4]。因此，通过有效抑制或者减缓椎间盘纤维环细胞凋亡，对于防治颈椎病具有重要意义。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞凋亡、增殖以及细胞外基质稳定的重要途径，在调控椎间盘纤维环细胞凋亡过程中发挥重要作用[5-6]。地塞米松是一种人工合成的糖皮质激素，具有抗炎、消肿、镇痛等作用，能够有效改善脊髓型和神经根型颈椎病患者的神经功能，提高临床疗效[7-8]。但是目前有关地塞米松治疗作用的机制尚不清楚。因此，本实验通过构建颈椎病模型大鼠，探究地塞米松对椎间盘纤维环细胞凋亡以及Wnt/β-catenin信号轴相关蛋白Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达的影响，以期为其临床治疗提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性、SPF级、SD大鼠40只，购买于中国科学院实验动物研究所(许可证号：SCXK(京)2019-0010)，适应性喂养1周，自由饮水，昼夜交替光照，温度维持在20～25 ℃，相对湿度60%～70%。动物实验经过本院动物伦理委员会审核批准(批准号：202002003)，实验满足3R原则。

1.1.2 试剂

醋酸地塞米松注射液(成都天台山制药有限，国药准字：H21020514)；美洛昔康片(上海勃林格殷格翰药业有限公司，国药准字：H20020217 )；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H-E)染色试剂盒(批号：C0105S)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号：C1088)、羊抗兔IgG抗体(批号：A0239)、羊抗鼠IgG抗体(批号：A0192)购自上海碧云天生物技术；Bax抗体(批号：ab36898)、Bcl-2抗体(批号：ab8805)、Wnt1抗体(批号：ab38449)、GSK-3β抗体(批号：ab32536)以及β-catenin抗体(ab32572)购自英国Abcam公司；β-actin抗体(批号：AF5001)购自上海碧云天生物技术。

1.1.3 仪器

TWK-FST32型组织匀浆仪(武汉泰普拓公司)；Micro17R型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自动多功能酶标检测仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；1658033型电泳仪(美国伯乐Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 颈椎病模型大鼠构建及给药处理

实验SD大鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组、阳性对照药(美洛昔康)组，每组各10只。依据文献[9]复制颈椎病模型大鼠，即对大鼠颈背部正中采取纵向切口，切口长度约2 cm，使其充分暴露各层肌肉，横向切断深群颈夹肌、头、颈、寰最长肌，之后完全切除颈髂肋肌与头半棘肌，依次切断C2～C7棘上和棘间韧带，缝合，手术后正常饲养1个月。对照组仅给予局部皮肤切开。实验通过H-E染色观察颈椎病模型大鼠是否构建成功。成功标准以纤维环软骨表面粗糙、髓核皱缩，髓核与纤维环之间的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有轻微的外突，软骨细胞有退行性病变等现象判定造模成功。待造模成功后，地塞米松组大鼠给予尾静脉注射0.4 mg/kg 的地塞米松，1次/d，14 d为一疗程，共治疗2个疗程，每个疗程间隔2 d。美洛昔康组大鼠进行灌胃处理，灌胃剂量按照《动物实验方法学》[10]人与大鼠体表面积药物等效剂量计算为0.75 mg/kg，治疗周期与地塞米松一致。

1.2.2 椎间盘纤维环组织病理学检测

4%的多聚甲醛固定大鼠椎间盘纤维环组织，经过包埋、切片、脱水，H-E染色观察椎间盘纤维环组织形态学变化。

1.2.3 椎间盘纤维环细胞凋亡检测

按照末端脱氧核糖转移介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记(terminal deoxy nucleo tidyl transferase mediated dUTP-biotin nick-end labeling，TUNEL)法测定大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡，细胞核呈棕色的细胞为凋亡细胞。石蜡切片置于60℃烤箱内脱蜡，然后使用二甲苯浸洗2次，每次约5 min。之后用梯度乙醇溶液(100%、95%、80%、70%)清洗各1次，每次约3 min。采用Proteinase K工作液处理心肌组织切片20 min，并在室温条件下加入细胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反应混合液，反应30 min。切片风干后，加入50 μL的 Converter-POD，加上盖玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB显色液，孵育10 min，光学显微镜下观察TUNEL阳性细胞数目并拍照。细胞凋亡率(%)=TUNEL阳性细胞数目/细胞总数目×100%。

1.2.4 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达

收集各组大鼠椎间盘纤维环组织并对组织碾磨；裂解；BCA法测定蛋白质浓度；凝胶电泳；湿转转膜；上样；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应Bax抗体(1：1000)，Bcl-2抗体(1：1000)，Wnt1抗体(1：1000)，GSK-3β抗体(1:1000)，β-catenin抗体(1：1000)以及β-actin抗体(1：2000)，4 ℃过夜，孵育对应的羊抗兔IgG抗体或者羊抗鼠IgG抗体(1：5000)1～2 h，；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，然后加入显影液，显影并拍照。Bax、Bcl-2、Wnt1、GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值相比反映。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行分析，数据以“¯x±S”表示，多组均数比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地塞米松对颈椎病大鼠椎间盘纤维环组织病理学变化的影响

对照组大鼠椎间盘纤维环软骨表面光滑，胶原纤维跑列规则，髓核与纤维环之间分界清晰。模型组大鼠纤维环软骨表面粗糙，髓核皱缩，髓核与纤维环之间的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有轻微的外突，软骨细胞有退行性病变。地塞米松组和美洛昔康组大鼠椎间盘纤维环组织病理学损伤均得到明显改善，软骨退行性改变减轻。

2.2 地塞米松对颈椎病大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡的影响

如图1、图2所示，与对照组相比，模型组大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡指数以及Bax表达均显著升高(P<0.01)，Bcl-2表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比，地塞米松组大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡指数以及Bax表达均显著降低(P<0.01)，Bcl-2表达显著升高(P<0.01)。

图1 地塞米松对颈椎病大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡的影响(400×)注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

图2 地塞米松对颈椎病大鼠椎间盘纤维环凋亡相关蛋白表达的影响注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

2.3 地塞米松对颈椎病大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt/β-catenin信号轴的影响

如图3所示，与对照组相比，模型组大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达均显著降低(P<0.01)。与模型组相比，地塞米松组大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。

图3 地塞米松对大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达的影响注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05, ##P<0.01。

3 讨论

椎间盘退行性病变与椎间盘组织细胞凋亡密切相关。研究证实，椎间盘纤维环细胞凋亡可导致基质代谢紊乱，进而促进其在组织、功能上发生变化，并最终诱发椎间盘硬化以及强度降低[11]。因此，通过寻找有效药物抑制或延缓椎间盘纤维环细胞凋亡，可能是改善椎间盘退行性病变的重要途径之一。

地塞米松是临床上常用的糖皮质激素，能够有效减轻神经根水肿，是硬膜外阻滞的相应配方药物。既往研究显示，地塞米松能够改善椎间盘突出模型大鼠的机械疼痛[12]。另外，地塞米松能够改善神经根型颈椎病患者颈肩疼痛、上肢放射痛以及串麻感等典型症状[13]。而在多节段脊髓型颈椎病患者中，地塞米松能够显著减轻患者的疼痛症状以及降低术后并发症[14]。以上研究表明，地塞米松能够有效改善多种类型颈椎病。但是，目前有关地塞米松对于动静力失衡性颈椎病模型大鼠的作用尚不清楚。因此，本研究首先通过复制动静力失衡性颈椎病模型大鼠，观察地塞米松的治疗作用。结果显示，模型组大鼠纤维环软骨表面粗糙，髓核皱缩，髓核与纤维环之间的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有轻微的外突，软骨细胞有退行性病变，表明模型构建成功。在模型构建成功的基础上，通过大鼠尾静脉注射地塞米松。结果显示，大鼠椎间盘纤维环组织病理学损伤得到明显改善，软骨退行性改变减轻，表明地塞米松对大鼠颈椎间盘退行性病变具有一定的疗效。细胞凋亡是椎间盘退行性病变的重要途径，其中Bax/Bcl-2表达失衡是导致细胞凋亡的关键性蛋白。为此，本实验进一步探究地塞米松对颈椎病模型大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡的影响。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠椎间盘纤维环组织Bax表达升高，Bcl-2表达降低，细胞凋亡指数显著升高，表明椎间盘纤维环细胞异常凋亡可能是造成椎间盘退行性病变的重要病理机制，这与以往研究结果一致[15]。与模型组相比，地塞米松组大鼠椎间盘纤维环组织Bax表达降低，Bcl-2表达升高，细胞凋亡指数显著降低，表明地塞米松可能通过抑制椎间盘纤维环细胞凋亡，进而改善颈椎病大鼠椎间盘退行性病变。关于地塞米松调控椎间盘纤维环细胞凋亡的相关途径，Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞凋亡、增殖等生物学功能的关键途径之一，在软骨细胞生长、分化以及细胞外基质代谢中发挥重要作用。既往研究证实，Wnt/β-catenin信号传导机制主要为Wnt蛋白与细胞膜受体结合，进而将信号传导至胞内抑制GSK-3β，降低β-catenin的降解，从而促使细胞质内游离的β-catenin含量增加，异位至细胞核形成T细胞因子/淋巴样增强因子复合物，调控Wnt/β-catenin信号途径中的靶基因，发挥调控细胞凋亡作用。另外，Wnt信号途径在类风湿性关节炎患者中同样发挥了重要作用，其可以通过影响成纤维细胞、成骨细胞等增殖和凋亡，促进骨质疏松以及骨质侵蚀等进展[16=17]。在椎间盘细胞中Wnt/β-catenin信号被激活，细胞增殖显著降低，加速了细胞衰老，从而促进椎间盘退行性病变[18-19]。以上研究均共同表明，Wnt/β-catenin信号在椎间盘退行病变，特别是细胞凋亡中发挥了重要作用。为此，本实验通过Western blot检测椎间盘纤维环组织Wnt/β-catenin信号相关蛋白，结果显示，与对照组相比，模型组大鼠椎间盘纤维环组织Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达均显著降低，研究结果与Smolders等[20]一致。与模型组相比，地塞米松组大鼠椎间盘纤维环组织Wnt1、GSK-3β和β-catenin表达均显著升高。

综上所述，本研究显示，地塞米松可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路关键因子Wnt1、GSK-3β和β-catenin蛋白表达，从而抑制颈椎病模型大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡。以上研究初步揭示了地塞米松对颈椎病椎间盘纤维环细胞凋亡的作用机制，为其临床应用提供了新的理论基础。

致谢：

感谢安徽医科大学实验中心老师提供平台和指导全程实验！