白花丹素对类风湿关节炎大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响＊

梅敦成，黄 恒，杨庆红

（湖北省第三人民医院阳逻院区 武汉 430000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种受环境和遗传因素共同影响的炎症性关节炎症，其作为自身免疫性系统疾病[1]，关节肿胀、疼痛、功能下降、变性是其主要临床表现，而其主要特征在于慢性炎症，可刺激关节滑膜成纤维细胞增殖，进而引发滑膜炎，而增生组织入侵软骨或骨组织会造成患者软骨、骨骼损伤，甚至残疾，严重影响患者寿命和生活质量[2-4]，由此，抑制滑膜增生对治疗RA具有重要作用[5]。目前甲氨蝶呤及地塞米松等抗风湿药是治疗RA的常用药物，虽然可在一定程度上缓解疾病程度，但该治疗方发并非对所有患者有效，有许多患者对该类治疗药物无反应，因此有必要寻找新的治疗药物以提高治疗效果[3]。

白花丹是一种天然野生草药，对风湿性关节疼痛、血瘀闭经等疾病具有较好的改善作用，白花丹素（plumbagin，PLB）是其主要有效成分，有抗炎抑菌、抗纤维化等作用[6]。研究表明，PLB能有效促进人RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）凋亡并抑制炎症反应，从而对RA具有改善作用[7]。Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路对大量与代谢、生长相关的基因具有调控作用，并且与骨质疏松、股骨头坏死、骨关节炎等骨相关疾病的发生密切相关[8-10]，除此之外，其已被发现在RA中具有重要作用，其激活可导致关节滑膜增生及滑膜液中大量炎性因子的分泌，造成滑膜炎症损伤[5]。在人骨肉瘤细胞中，PLB能够通过抑制Wnt/β-catenin通路信号转导起到抗骨肉瘤细胞增殖的作用[11]。

目前关于PLB对RA中Wnt/β-catenin通路的影响还未见报道，并且PLB在RA中的影响机制是否可能与其调控Wnt/β-catenin通路有关也未可知。因此，本研究以期通过探究PLB对CIA大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响，以及其在RA中的可能作用机制，为RA新治疗药物的寻找提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

从长春市亿斯实验动物技术有限责任公司购买60只SPF级SD大鼠（242-289 g），许可证：SCXK（吉）2016-0004，于正常12 h明暗交替环境中适应性饲养一周，期间保持环境通风，大鼠自由饮水、采食，实验前禁食12 h。

1.2 主要试剂

白花丹素（货号：T2841c）购自TargetMol公司；地塞米松（批准文号：国药准字H20053754）购自西安国康瑞金制药有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）酶 联 免 疫 吸 附 实 验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检 测 试 剂 盒（货 号：ER1393、ER0042）购自武汉菲恩生物科技有限公司；HE染色试剂盒（货号：G1120-100）购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白提取试剂盒（货号：CD-13559-ML）购自武汉纯度生物科技有限公司；蛋白检测试剂盒、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体（货号：HR0329-ZHV、JN0200-GLH）购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗β-actin（货号：4970）、β-catenin（货号：8480）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）（货号：9315）、Wnt3a抗体（货号：2721）购自Cell Signaling Technology；基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）（货号：18165-1-AP）购自Proteintech。

蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；Von Frey纤维丝测痛仪购自上海玉研科学仪器有限公司；热痛敏刺激仪购自天津伯尔尼科技有限公司；SpectraMax iD3多功能酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 分组与模型构建

将60只SD大鼠（每组10只）随机分为对照组、模型组、地塞米松组（模型+30 mg·kg-1地塞米松）[12]、PLB-L组（2 mg·kg-1PLB）、PLB-M组（4 mg·kg-1PLB）、PLB-H组（6 mg·kg-1PLB）[13]。关 节 炎（collageninduced arthritis，CIA）模型构建：10 mg牛II型胶原与0.1 mol·L-1冰醋酸（5 mL）混匀后4℃过夜，将上述溶液与完全弗氏佐剂等体积混合、乳化（质量浓度1 g·L-1）于右后足跖足垫皮下注射0.1 mL，7天后以相同溶液于尾根部注射0.1 mL进行加强免疫1周，若大鼠出现四肢甚至尾部出现红肿即全身多发性关节炎，视为造模成功[12]；将造模成功的大鼠进行为期2周的灌胃，地塞米松组、PLB-L组、PLB-M组、PLB-H组大鼠分别每天给予等量的30 mg·kg-1地塞米松及2 mg·kg-1PLB、4 mg·kg-1PLB、6 mg·kg-1PLB，对照组与模型组大鼠给予等量生理盐水。

2.3 关节炎症积分评价

灌胃结束后进行关节炎症积分评价：0分（正常）：无肿胀，2分（轻度）：皮肤纹理变浅、骨标志明显、触之柔软、轻度肿胀，4分（中度）：皮肤纹理消失、骨标志不明显、触之发硬、明显肿胀，6分（重度）：严重肿胀、骨标志消失、皮肤紧绷、触之发硬[12]。

2.4 大鼠热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）及机械性痛阈（paw withdrawal mechanical threshold，PWT）检测

使用热痛敏刺激仪照射各组大鼠后足底掌心，当大鼠后足移动时系统记录反映时间，即为PWTL；使用von Frey纤维丝测痛仪中的Von Frey纤维丝刺激各组大鼠后足底中部至轻度弯曲5 s，大鼠后足骤抬即为一次阳性反应（每次间隔大于60 s），重复5次，若大于三次出现阳性反应，则此力度即为PWT[12]。

2.5 HE染色观察大鼠足关节滑膜组织病理学变化

随机取5只大鼠，腹腔注射水合氯醛（10%）进行麻醉后于关节腔中注射生理盐水（1 mL），活动关节，抽取并收集关节液后取足关节滑膜组织于4%多聚甲醛中固定，24 h后乙醇脱水、石蜡包埋、切片（4 µm）、二甲苯脱蜡及梯度乙醇处理，再进行HE染色、脱水、封片、显微镜观察（n=5）。

2.6 ELISA法检测大鼠关节液中炎症因子水平

取2.5所得关节液，严格根据TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒说明书实验步骤进行操作，于酶标仪450 nm处检测关节液中二者的水平。

2.7 免疫应迹法检测关节滑膜组织中蛋白表达情况

另取5只大鼠关节滑膜组织，在研钵中研磨后通过苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride、PMSF）裂解后提取总蛋白，经二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测总蛋白含量；取上样缓冲液与蛋白混匀后100℃进行5min变性，以每孔40µg的量进行SDS-PAGE凝胶电泳，低温转移蛋白至聚偏氟乙烯（Poly vinylidene fluoride)，PVDF）膜上，5%的脱脂奶粉封闭（1 h）后，1：1000加入兔抗β-actin、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13一抗孵育（4℃）过夜，PBS清洗3次后HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:3000）孵育2 h，添加免疫印迹化学发光试剂（ECL Reagent）进行显色，蛋白凝胶成像仪观察，定量分析各蛋白含量（n=5）。

2.8 统计学分析

数据采用SPSS 23.0统计学软件进行分析，计量资料用平均数±标准差（xˉ±s）进行描述，多组间行单因素方差分析，采用snk-q检验进行多组间进一步两两比较；P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结论

3.1 各组大鼠一般情况比较

对照组大鼠皮毛光亮、关节无肿胀、可灵活运动；模型组大鼠皮毛无光泽、关节肿胀、跛行、活动量与进食量减少、精神倦怠；地塞米松组、PLB-L组、PLB-M组和PLB-H组大鼠皮毛光泽度、脱毛情况、饮食、精神及行动以PLB剂量依赖性的方式得到改善。

3.2 PLB对大鼠PWT、PWTL、关节炎症积分的影响

与对照组相比，模型组大鼠PWT、PWTL显著降低，而关节炎症积分显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，地 塞米 松 组、PLB-L组、PLB-M组 和PLB-H组PWT、PWTL显著增加，而关节炎症积分显著降低（P＜0.05）；与PLB-L组相比，PLB-M组和PLB-H组PWT、PWTL显著增加，而关节炎症积分显著降低（P＜0.05）；与PLB-M组相比，PLB-H组PWT、PWTL显著增加，而关节炎症积分显著降低（P＜0.05）。与地塞米松组相比，PLB-L组、PLB-M组PWT、PWTL显著降低，而关节 炎 症 积 分 显 著 增 加（P＜0.05），PLB-H组PWT、PWTL、关节炎症积分无显著性差异（P＞0.05）（表1）。

表1 PLB对大鼠PWT、PWTL、关节炎症积分的影响（n=10，xˉ±s）

3.3 PLB对大鼠足关节滑膜结构的影响

对照组大鼠关节滑膜结构正常，无病理学现象；模型组出现炎性细胞浸润、滑膜层水肿、增厚明显；地塞米松组、PLB-L组、PLB-M组和PLB-H组炎性细胞浸润、滑膜层水肿增生现象以PLB剂量依赖性的方式逐渐减少（图1）。

图1 大鼠足关节滑膜结构组织病理学观察（HE，200×）

3.4 PLB对大鼠关节液中炎症因子水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠关节液中TNF-α、IL-6水平显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，地塞米松组、PLB-L组、PLB-M组和PLB-H组TNF-α、IL-6水平显著降低（P＜0.05）；与PLB-L组相比，PLB-M组和PLB-H组TNF-α、IL-6水平显著降低（P＜0.05）；与PLB-M组相比，PLB-H组TNF-α、IL-6水平显著降低（P＜0.05）；与地塞米松组相比，PLB-L组、PLB-M组TNF-α、IL-6水平显著增加（P＜0.05），PLB-H组TNFα、IL-6水平无显著性差异（P＞0.05）（表2）。

表2 PLB对大鼠关节滑膜组织炎症因子水平的影响（n=5，xˉ±s）

3.5 PLB对大鼠关节滑膜组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白的影响

与对照组相比，模型组大鼠关节滑膜组织Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，地塞米松组、PLB-M组和PLBH组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著降低（P＜0.05），PLB-L组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达无显著差异（P＞0.05）；与PLB-L组相比，PLB-M组和PLB-H组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著降低（P＜0.05）；与PLB-M组相比，PLB-H组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著降低（P＜0.05）；与地塞米松组相比，PLB-L组、PLB-M组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著增加（P＜0.05），PLB-H组上述蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）（表3、图2）。

图2 PLB对大鼠关节滑膜组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白的影响

表3 PLB对大鼠关节滑膜组织炎症因子水平的影响（n=5，xˉ±s）

4 讨论

白花丹具有散於、消肿、止痛的功效，可用于治疗跌打损伤、风湿性关节痛等病症，大量研究证实，其在膝关节骨性关节炎、RA等关节疾病中具有明显改善作用，而PLB是一种从白花丹中提取的具有免疫抑制特性的小分子化合物，在治疗骨折、细菌感染、关节肿胀中疗效甚佳，研究发现其在胶原蛋白诱发的关节炎中不仅可有效抑制破骨细胞增殖，还能通过调节调节性T细胞（Treg）/辅助性Th17细胞失衡，抑制炎症反应[13-16]。PLB不仅能预防白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）诱导的骨关节炎模型小鼠软骨破坏及软骨下骨增生，还能有效抑制小鼠滑膜炎的发生，因此可能是骨关节炎的潜在治疗药物[17]。随着关节肿胀的发作，滑膜会呈现出增生及巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等炎性细胞浸润现象[2]。FLS是RA发生时的主要效应细胞，其增殖过度是关节炎症及关节破坏的主要原因之一，因此抑制其增殖对RA的治疗十分重要，而PLB能通过抑制Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和信号转导和转录活化因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription protein，STAT3）信号通路来有效促进RA大鼠FLS凋亡、抑制细胞增殖及炎症反应[6-7]。虽然PLB在多种类型关节疾病中具有良好的改善作用，但其在RA中的相关研究甚少。因此，本研究通过构建CIA大鼠模型探究PLB对RA的改善机制发现，PLB能有效改善CIA大鼠行为学变化及足关节滑膜组织病理学程度，增加PWT、PWTL，降低关节炎症积分、TNF-α和IL-6水平，与前人研究结果相一致。PLB可能是通过某种机制来降低CIA大鼠炎症因子的分泌，以此减轻足关节滑膜组织病理损伤，上述结果表明，PLB能有效抑制CIA大鼠关节滑膜增生及炎症反应，有作为RA潜在治疗药物的可能。

Wnt家族蛋白质与骨骼形成、组织修复、关节内稳态密切相关，而β-catenin过表达可加剧软骨细胞肥大、软骨变性，促进基质蛋白酶的表达[18-20]。Wnt/βcatenin是一个经典的Wnt信号通路，其在正常状态下处于静止状态，可在器官受到损伤时被激活，研究发现其在骨关节炎关节软骨及滑膜中处于激活状态，抑制该通路可改善骨关节炎小鼠及RA大鼠模型的关节炎程度[18,21]。补肾祛寒治尪汤可通过抑制Wnt/βcatenin通路激活，来缓解胶原所诱导的关节炎大鼠关节炎症状及骨破坏[22]。Wnt/β-catenin参与滑膜成纤维细胞中的炎症反应，RA患者滑膜组织中β-catenin表达水平异常增加，因此抑制其信号转导是治疗RA的重要环节[5,23]。有研究发现，抑制Wnt-3α/β-catenin信号通路可显著缓解RA患者关节疼痛，改善关节功能[24]。GSK-3β可与β-catenin相结合参与细胞增殖、分化[23]。MMPs能够降解关节软骨中的胶原、蛋白等大分子，而且来源于滑膜细胞的MMPs还能够导致关节病理性损伤，抑制其产生对RA的治疗至关重要，研究发现，Wnt/β-catenin通路激活可促进MMP-13分泌[25]。本研究发现，CIA模型大鼠关节滑膜组织中Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平显著增加，与前人研究结果相似，该结果表明，Wnt/βcatenin通路在CIA大鼠关节滑膜组织被显著激活，其参与RA的发生，CIA大鼠炎症反应及关节滑膜组织病理损伤的发生可能与该通路的激活有关。有报道称，PLB能够通过抑制Wnt/β-catenin途径来抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭，以及血管生成[26]。而PLB是否可能影响CIA大鼠Wnt/β-catenin途径的激活还未可知，因此本研究通过对其探究发现，PLB能显著降低CIA大鼠Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表达水平。该结果表明，PLB能够有效抑制CIA大鼠Wnt/βcatenin途径的激活，而PLB对CIA大鼠潜在的治疗作用可能与其抑制该通路有关。

综上所述，PLB对CIA大鼠关节滑膜增生及炎症反应的抑制作用，可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究不仅为RA新药的寻找提供参考，还对其发病机制的研究具有重要意义，但由于模型样本受限，研究未对Wnt/β-catenin信号通路的下游详细机制进行探讨，因此在未来的研究中还需扩大样本，对其下游机制进行深入探究。