整合的HBV DNA在慢性乙型肝炎患者病毒复制及慢性感染维持中的潜在作用

李玉坤 顾智强 姜倩倩 陈香梅 鲁凤民

慢性感染是乙型肝炎病毒(HBV)最主要的致病形式。而以微小染色体形式存在于感染肝细胞核的长度3.2 kb的共价闭合环状DNA(cccDNA)对于病毒复制及慢性感染的持续至关重要，并与慢性乙型肝炎(CHB)难以治愈和抗病毒治疗停药后的病毒反弹及疾病复发相关。作为病毒复制的源头，cccDNA可以转录出超基因组全长的3.5 kb前基因组RNA(pgRNA)和亚基因组RNA(2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb RNAs)[1]，其中pgRNA既是编码病毒核心蛋白(core)和具有逆转录酶活性的病毒DNA聚合酶蛋白(polymerase, pol)的mRNA，也是在由core蛋白构成的核衣壳内pol蛋白逆转录酶作用下合成子代病毒基因组——松弛环状DNA(rcDNA)负链的模板[2]。在逆转录过程中，pol蛋白需要完成三次正确的跳转才能产生子代rcDNA，若pol蛋白未发生第二次跳转，而在原位启动正链DNA的合成，则会形成双链线性DNA(Double strand linear DNA，dslDNA)[3]。本文回顾了现有的与HBV DNA整合相关的知识体系，特别是其能否通过产生和提供病毒包膜蛋白HBsAg及羧基端缺失的HBx蛋白等参与支持病毒的复制，及其在慢性HBV感染维持中的潜在作用。

一、HBV DNA整合的分子机制及表达特征

目前已知dslDNA是整合HBV DNA的前体和来源，可通过非同源末端连接或微同源末端连接等方式随机地整合至宿主DNA双链断裂处[4]。这里，我们通过对本实验室前期数据及网上可用的HBV整合的病毒断点数据的再分析，对整合的病毒片段断点的分布特征提出了新的观点。不同于既往的整合病毒DNA断点分布于DR1及DR2间的笼统叙述，我们认为正确的表述应该是：下游断点多集中在dslDNA下游端点的DR1残存(1827nt，不同基因型间的脱氧核苷酸序号可能存在差异，下同)周围，上游断点则位于pgRNA 5'端残留起始(1818nt)至上游DR1(含该DR1的1824-1834nt重复序列)区域附近(图1)。这一表述与dslDNA的两端断点一致，更符合dslDNA为整合病毒DNA前体(precursor)的推测[5-6]。而之所以在实测的临床样本中出现断点自dslDNA两端内移的现象，多是因为整合的病毒-宿主融合位点微小区域的染色体不稳定性[2]，及伴随着携带整合片段肝细胞在肝脏炎症坏死后的代偿性克隆扩增带来的病毒序列的微小缺失等改变所致。

从众多已知的整合病毒DNA的两端断点推测，整合的HBV DNA序列多保留有完整的编码大、中、小表面抗原的preS/S区及羧基端部分缺失的X基因区(图1)，该推测被近期的一系列基因组长测序结果所证实[7]。由此以来，整合的HBV DNA能够在其自身启动子的作用下转录出对应的2.4、2.1 kb 转录本及能够翻译出羧基端缺失并融合了部分宿主基因组序列的X基因转录本。既往研究也证实，整合HBV DNA可以支持乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)和羧基端截短的HBx蛋白的表达[8-9]。同时，由于启动子移位无法转录出超基因组全长的3.5 kb的pgRNA，“有缺陷”的整合HBV DNA不能单独支持子代病毒基因组rcDNA的产生[10]。

二、HBV DNA整合与肝细胞癌发生

由于病毒DNA整合入宿主基因组事件可发生于包括感染早期在内的任何阶段，且其在人染色体上整合具有随机性，不同自然病程的CHB患者肝组织中均可以检测到独特的病毒-宿主DNA融合的整合事件[11]。目前关于HBV整合的研究多聚焦于整合事件的致肝细胞癌(HCC)作用。机理上，已知HBV DNA整合可通过以下三种主要机制促癌：(1)扰乱宿主癌基因的表达及其功能，包括细胞增殖等促癌基因如TERT、CCNE1和MLL4等的激活[12]，及抑癌基因的功能失活等[5]；(2)促进宿主染色体特别是整合位点局部基因组的不稳定性[13-14]；(3)野生型和截短/融合病毒蛋白(HBx、preS/S)的致癌作用[15]。一般认为，HBV DNA整合的上述致HCC作用是与病毒所致肝脏的炎症微环境相互作用的综合结果，炎症所致肝细胞的死亡诱导了残余肝细胞的再生，而携带上述整合的肝细胞会因具有增殖优势而被克隆性扩增，并积累更多的突变最终导致HCC的发生。

三、HBV DNA整合对病毒复制的影响及其慢性感染维持中的可能作用

目前，人们对于整合的HBV在病毒复制及慢性HBV感染维持中的作用仍然知之甚少。诚如前面所提，由于整合的HBV DNA前体dslDNA的全长仅为3.2 kb，无法转录出3.5 kb的pgRNA以支撑病毒DNA复制，故HBV DNA的整合事件被认为是错误跳转带来的副产品，这很容易让人认为整合的HBV DNA并不参与病毒的复制。但对此也有人持不同的观点。近期Erken等[16]建立了检测CHB患者肝组织中整合HBV DNA水平的半定量巢氏Alu-PCR技术，并通过整合HBV DNA水平与患者血清病毒学指标的相关性分析，以期找出HBV DNA整合参与病毒复制的潜在证据。尽管我们的工作提示Erken等[17]采用的检测整合HBV转录本的RT-Alu-PCR技术可能会漏掉大部分整合HBV的转录本，但仍应重视HBV DNA整合在病毒复制和慢性感染维持中的作用[18]。据此，本文总结了既往的研究发现，并结合我们自己的工作，尝试从以下四方面进一步阐述HBV整合在病毒复制及慢性感染维持中的潜在作用。

(一)整合来源的HBsAg可为病毒复制提供包膜并维持持续感染 慢性HBV感染者血清HBsAg有cccDNA及整合的HBV DNA两个来源，特别是对于乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性患者，整合的HBV DNA可能是其血清HBsAg的主要来源[19]。不仅如此，Freitas等发现，存在HBV DNA整合的PLC/PRF/5细胞系可以为丁型肝炎病毒(HDV)提供功能性包膜蛋白[20]。有关整合来源的HBsAg支持病毒包膜形成的实验证据还包括：由于pol蛋白的逆转录酶活性缺乏矫正阅读功能，HBV基因组(cccDNA)的preS/S区可有高频的可导致HBV分泌和感染缺陷的突变发生[21-22]，但在这些CHB患者体内却可检测到preS/S区突变毒株的持续存在[23]，提示整合HBV DNA来源的功能性HBsAg可能弥补了preS/S区突变毒株的缺陷以维持该类毒株的持续感染。如果存在于肝细胞核内的cccDNA分子在不同的时空的某一节点仅转录一种病毒转录本，我们或许可以想象随着疾病进展和病毒与宿主免疫的博弈，HBeAg阴性患者部分肝细胞核内残留的数量显著减少的cccDNA可能只具备转录pgRNA的能力了。此时，来自整合HBV DNA的病毒包膜蛋白将协助其形成具有感染能力的子代病毒颗粒。当然，该推测尚需更多的实验证据的支持。

(二)整合的HBV DNA促进HBV复制的可能机制 整合HBV DNA表达的野生型或突变型HBsAg均可引起内质网应激[24]。Wang等[25]研究发现，HBV可利用内质网应激所启动的自噬作用来增强HBsAg的产生及HBV的复制和分泌。此外，HBx通过促进宿主SMC5/SMC6复合物的降解，增强cccDNA的转录和病毒复制[26]，为新合成cccDNA获得转录活性和活性维持及病毒的持续复制所必须[27]。此外，作为共转录调控因子，HBx的羧基端(51-154aa)含有可转录激活cccDNA的反式激活结构域[28]。需要注意的是，整合过程中dslDNA的末端常发生缺失突变，由dslDNA两端向内缺失最长可达200 bp[29]，对应产生羧基端不同程度截短的CtHBx，其对于cccDNA的转录调控作用可能会不尽相同，有待进一步研究。

图1 经典双链线性DNA的序列特征(以HBV C基因型为例)

(三)整合HBV DNA为HBeAg阴性患者HBsAg主要来源的可能机制 尽管高水平的HBeAg和HBsAg具有免疫抑制作用[30-31]，但HBeAg的免疫原性可能更强。因此，在慢性HBV感染的自然进程中，往往会发生HBeAg的阴转，提示宿主免疫应答更倾向于清除表达HBeAg的cccDNA转录活跃的肝细胞，这一过程往往会诱发残存肝细胞的代偿性增殖，一方面会导致cccDNA池的进一步丢失，一些存在整合的肝细胞则可能会因代偿性增殖并进一步克隆性扩增而逐渐增加[32-33]。在长期的疾病进展过程中，患者的HBeAg发生阴转或血清学转换，整合的HBV DNA逐渐成为其HBsAg的主要来源[34-35]。

(四)整合HBV DNA与CHB患者难以达到临床治愈有关 无论是自发，还是经过抗病毒治疗，血清HBsAg消失的CHB患者往往有更好的近期和远期结局，并被定义为临床治愈[36]。尽管人们知道血清HBsAg有cccDNA和整合HBV DNA两个来源，但靶向HBV转录本3'端共同序列的首个RNA干扰候选药物ACR-520在HBeAg阴性的慢性HBV感染黑猩猩中失去显著抑制血清HBsAg的作用[37]。究其原因在于ACR-520靶向的mRNA序列位于病毒整合下游断点之后，对整合来源pres/s转录本并无干扰作用[37]。最近高志良团队对CHB患者的HBV DNA整合分析结果证实，与未实现临床治愈者相比，临床治愈患者肝组织内整合的HBV DNA有着极为明显的减少[38]，也说明了整合HBV DNA来源的HBsAg的存在使患者难以达到临床治愈。

四、小结

HBV DNA整合一直被认为是HCC发生的主要危险因素之一，但随着对HBV DNA整合的分子机制和致病机理的进一步认识，确证了尽管HBV DNA整合不会产生具有复制能力的转录本，但可以表达大、中和小HBsAg，以及羧基端截断的HBx。在病毒复制及慢性感染维持方面，整合的HBV DNA可能在以下几个环节参与其中：(1)转录表达HBsAg为病毒提供包膜以维持HBV的持续感染；(2)整合来源的HBsAg和羧基端截断的HBx可能参与cccDNA的转录活性调节和病毒复制；(3)在长期的病毒-宿主相互作用下，肝脏中的整合事件通过免疫逃逸和肝细胞克隆性扩增而逐渐增加，而cccDNA池则逐渐丢失或转录沉默，最终可能导致整合的HBV DNA成为HBeAg阴性患者血清HBsAg的主要来源。除此之外，整合HBV DNA的持续存在与表达，可能是CHB特别是HBeAg阴性患者难以治愈的主要原因。未来，应进一步加强对HBV整合参与病毒复制及维持慢性感染的作用及相关机制的研究，以进一步提高CHB患者的临床治愈。