炭疽毒素调节痛觉信号并运送分子物质到ANTXR2+背根神经节感觉神经元

2022-10-15YangNJ,IsenseeJ,NeelDV等

中国疼痛医学杂志 2022年6期

一、主要研究背景

疼痛是一种不愉快的感觉，起始于躯体感觉神经元对伤害性热、机械和化学等刺激的反应。寻找选择性靶向沉默伤害性神经元的新策略将有助于镇痛新疗法的研发。天然毒素是选择分子试剂的丰富来源，能够靶向调节神经元的功能。近来研究发现，细菌产物可作用于感觉神经元而调控感染诱发的疼痛和咳嗽。该研究的目的是识别细菌产物作用于DRG 感觉神经元上的受体，并研究相关细菌产物是否调节疼痛。通过转录组数据分析，研究者发现DRG 内Na

1.8

神经元上的ANTXR2 分子，是炭疽毒素的高亲和受体。炭疽毒素是炭疽杆菌的主要毒素，包含PA（保护性抗原）、LF（致命因子）和EF（水肿因子）三种蛋白，构成两种二分体毒素：致命毒素 (LT = PA + LF) 和水肿毒素(ET = PA + EF)。中毒时，PA 与炭疽毒素受体结合，并在内吞小泡上打孔，LF 和EF 通过其N 端结构域与PA 打的孔隙结合而进入细胞。LF 是锌指金属蛋白酶，可剪切丝裂原激活蛋白 (MAP) 激酶、炎症小体感受器Nlrp1 和磷酸肌醇-3 激酶的调节亚基p85α和p85β。EF 是钙和钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶(AC)，可将ATP 转化为cAMP。

PA 有两个结构同源受体：ANTXR1 (TEM8)和ANTXR2 (CMG2)。PA 与ANTXR2 的亲和力比ANTXR1 高很多，ANTXR2 缺失小鼠对炭疽毒素和炭疽杆菌感染具有抵抗力，表明ANTXR2 是炭疽毒素在体内的主要功能受体。

炭疽毒素除了作为病原菌，还可用作运送系统而将功能性分子物质运送到靶细胞（如癌细胞）的胞质中。把外源分子连接到LF 的N 端结构域(LF

)，就能通过PA 打的孔隙被传递到细胞内，可以运送与蛋白结合的各种分子、非常规的多肽和核酸等。此功能支持把炭疽毒素系统作为靶向神经元技术。

该研究发现ANTXR2 在神经系统中有着异乎寻常的表达模式：在大部分CNS 神经元中缺失，而富集在DRG 的Na

1.8

神经元中。在多个小鼠模型中，ET 鞘内注射靶向DRG 神经元可以抑制热痛和机械痛，镇痛作用依赖于Na

1.8

或Advillin

神经元上的ANTXR2 表达。ET 减弱了DRG 神经元到脊髓背角的神经传递功能。炭疽毒素系统将多种非自身蛋白运送到感觉神经元，具有作为输送镇痛蛋白质平台的潜力。

二、主要研究结果

1. ANTXR2 表达于Nav1.8+ DRG 神经元上

通过基于流式分选的小鼠DRG 神经元的转录组数据分析，发现

在Na

1.8 品系小鼠(Scn10a

) 神经元富集，且比在parvalbumin品系鼠(Pvalb-cre

) 的本体感受神经元高5倍；通过小鼠DRG 神经元的单细胞RNA 测序，发现

在表达

(Na

1.8)、

、

(CGRP)、

和

(TrkA) 伤害感受器中表达最高。

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RNAscope（RNA 原位杂交）实验证实，小鼠DRG 中存在

转录本，在中、小直径神经元中表达最高，大多数

细胞表达

，只有小部分

细胞表达

；

广泛表达在人躯体感觉神经元中，包括介导伤害感受的

、

和

神经元；

主要表达在中、小直径的DRG 神经元中；人

RNA 在DRG 的RNA 中比脑组织RNA的表达水平高。以上分析表明Antxr2 在人和小鼠躯体感觉神经元中都有表达，包括伤害性感受器。

2. LT 和ET 诱发DRG 细胞信号

LT 处理体外培养DRG 细胞导致显著的MEK3分裂和p38 磷酸化降低，而单独给予LF 对MEK3分裂和p38 磷酸化都没有影响，表明PA 是LF 进入细胞内所必需的；仅给予ET 可使cAMP 水平升高；联合给予特定浓度的PA，EF 诱导cAMP 增高的EC

在46 pM。以上研究结果表明，炭疽毒素可以作用于培养的DRG 细胞，以依赖于PA 的方式干预细胞内信号。

3. ET 鞘内注射的镇痛作用

给药方法是单独给予2 μg PA，或2 μg PA + 2 μg LF 或EF，注射体积为5 μl。结果发现，ET 鞘内注射显著升高机械痛阈值和热痛潜伏期，可持续数小时；ET 作用是可重复的，在第1 次注射2 天后，再次鞘内注射ET 同样可以升高机械痛阈值，而且第2 次给药的镇痛作用更强，这可能是由于ET 诱导了ANTXR2 上调。

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ET 2 h 腹腔内注射实验鼠对伤害性热刺激和机械刺激（包括热板、冷板和针刺等）的反应减弱；Randall-Selitto 诱发反应也减弱，但在注射后5 h恢复正常；轻触觉也受到影响，可能由于ANTXR2在部分Aβ 和Aδ 低阈值机械感觉神经元中有表达；ET 鞘内注射对热痛阈和机械痛阈的影响无性别差异。

ET 鞘内注射2 h 后（2 h 腹腔内注射），DRGs中cAMP 水平升高，24 h 后恢复到基线水平；在脊髓水平，ET 2 h 腹腔内注射使cAMP 水平出现一个明显的小幅增加，可能是伤害感受器的cAMP 升高，但只是占整个脊髓组织小部分；而cAMP 的变化在后爪足底组织中没有被检测到。

4. 感觉神经元ANTXR2 介导ET 的镇痛作用

在Na

1.8

伤害性感觉神经元中(

Scn10a

Antxr2

)条件敲除

（经验证DRG 中

全长转录本的表达减少），与同窝对照鼠比较，ET的镇痛作用明显减弱；

Scn10a

Antxr2

鼠体外培养的DRG 细胞给予ET 后，cAMP 的合成也减少。Na

1.8

神经元中ANTXR2 的缺失不影响多数疼痛模式的基础阈值，但对福尔马林诱发的第二时相疼痛产生轻微的抑制作用，不影响角叉菜胶诱发的机械痛敏。表明ANTXR2 不影响伤害性疼痛的基础阈值，但对ET 的镇痛作用至关重要。

电生理研究发现，当注入小或中等电流时，给予ET 的DRG 神经元的兴奋性增强，而神经元的静息膜电位或输入电阻没有明显改变；在ET 处理的神经元中记录到的电压激活钙电流，与对照组比较无显著性差异；在培养的DRG 细胞中，给予ET 也不影响KCl 诱导的CGRP 释放。

5. ET 诱导小鼠和人iPSC（诱导多能干细胞）神经元中的PKA 信号

通过研究DRG 神经元中PKA 的激活情况，发现ET 稳步增加DRG 神经元亚群的PKA-II 活性，2 h 达饱和水平，其EC

在皮摩尔水平；而单独应用EF 或PA 则没有作用；单独应用PA、LF 或LT 都不影响PKA-II 活性；通过鉴定对ET 反应的DRG 神经元亚群，发现在所有伤害性神经元和非伤害性神经元中均可检测到PKA 活性，但程度不同；对ET 的反应与CaMKIIα 和Na

1.8 的表达正相关，与NF200 表达不相关；同Fsk 比较，ET 不增加非神经元细胞中的pRII 水平。总之，ET 在数小时内可剂量依赖性的激活感觉神经元和伤害性感受器内的PKA。

搓搓脚。在沐足过程中，可用双手按摩、揉搓脚背及脚心，以左手劳宫穴摩擦右脚底涌泉穴，右手劳宫穴摩擦左脚底涌泉穴，直到产生温热感为止。

通过定量DRG 冰冻切片上的神经元，揭示ET可在体诱导大量DRG 神经元中的PKA-II 激活；当基于小分子的分化方案将人类iPSCs 分化为具有伤害感受器表型的感觉神经元后，以EC

在皮摩尔水平的ET 进行刺激，即可升高pRII，表明人感觉神经元可能是炭疽毒素的靶标。

6. ET 调节神经活性和镇痛的诱导

在

Avil

ANTXR2

鼠，ET 的镇痛效应几乎被消除。与

Scn10a

Antxr2

条件敲除鼠比较，

Avil

Antxr2

鼠表现出更显著的减弱，可能是因为有少量的Antxr2

1.8

神经元参与镇痛作用。在内皮细胞内条件敲除

的

Cdh5

Antxr2

鼠和在髓系免疫细胞条件敲除Antxr2 的

Lyz2

Antxr2

鼠，ET 的镇痛作用没有受到显著的影响。表明神经元内的ANTXR2 对ET 镇痛作用至关重要，而内皮细胞和髓系免疫细胞几乎不参与ET 的镇痛作用。

阿片受体拮抗剂纳曲酮和纳洛酮或CB1 拮抗剂/反向激动剂Rimonabant 对ET 的镇痛作用没有显著的影响，化学交感神经切除鼠给予ET 仍然表现出明显的镇痛作用。另一种可能是，细胞外分泌的cAMP 转化成腺苷，作用于伤害性感受器上的腺苷受体而产生镇痛作用，但系统性给予泛腺苷受体拮抗剂CGS15943 并不影响ET 升高的热痛阈。

ET 2 h 后对DRG 的转录组检测分析发现转录组变化明显，包括

、

和

等上调和几种信号通路的改变（如磷酸化水平下调）。DUSP1 是一种可阻断与疼痛相关的MAPK 通路的磷酸酶，用DUSP1/DUSP6 拮抗剂BCI 药理方法抑制DUSP1 不影响ET 的镇痛作用。虽然以上研究没有明确DUSP1 的具体功能，但足以证明注射ET 数小时内可诱发体内DRG 的内在转录改变。

辣椒素鞘内注射刺激初级传入的中枢分支，观察pERK 磷酸化水平。结果发现鞘内注射后再注射辣椒素，可增加背角pERK 阳性细胞数；而先注射ET 再注射辣椒素可显著减少pERK 阳性细胞数。

7. ET 鞘内注射诱导DRG 转录改变

概念的掌握不等同于记忆名词，原理、概念表达的简洁性、正确性，结论的准确性尤其重要。所以地理教师要弄清楚知识的来龙去脉，掌握其确切的概念和规律，精心组织教学语言解读，确定怎样开头，怎样过渡，怎样结尾。只有概念精准思路井然有序，讲解才会条理清晰，学生在重点难点等关键问题上才能得到透彻的理解。

8. ET 减弱DRG 中枢末梢的神经传递

据了解，目前石柱县共整合涉农资金建立财政投入股权化资金8000万元，全面推行农业项目财政资金股权分红。截至目前，全县已组织实施股权收益扶贫项目167个，带动贫困户四千余户。

该研究进一步采用电生理实验观察ET 刺激背根是否可引起脊髓背角I 层神经元兴奋性突触后电流 (EPSCs) 的变化。给予ET 可缓慢减少C 纤维介导的EPSCs 达37%±4%，而配对脉冲比没有显著变化；在给予或不给予1 µM 河豚毒素的情况下记录微小EPSCs (mEPSCs)，应用ET 前后每个细胞mEPSCs 的频率和振幅的中位数无显著性差异；由于多数mEPSCs 似乎来源于脊髓中间神经元，对初级传入神经囊泡释放的贡献很小，相对于ET 导致EPSCs 大量减少，对mEPSCs 的影响却很小，这与前面的实验结果相一致，即ET 作用于初级传入神经元的ANTXR2 而发挥作用。以上研究结果表明ET 抑制了从C 纤维到脊髓背角I 层神经元的突触传递，并抑制了I 层神经元的激活。

9. ET 鞘内注射抑制神经病理性痛和炎性痛

小鼠SNI 神经病理性痛模型中，ET 鞘内注射阻断机械痛敏，但单独给予PA、EF 或LT 没有作用；ET 可使同侧和对侧机械痛阈值都升高，也升高同侧和对侧DRG 内cAMP 水平；ET 还减轻了福尔马林诱发的第一时相和第二时相疼痛；在角叉菜胶诱发的小鼠炎性痛模型中，鞘内注射ET 阻断了机械痛敏，此镇痛作用依赖于Na

1.8

神经元上的ANTXR2 表达；此外，在福尔马林和角叉菜胶模型中，ET 的镇痛作用在性别上无差异。