气相色谱法测定鱼油脂肪乳注射液中三酰甘油的含量

谢春燕，曾少群，岳峰

（1.广东嘉博制药有限公司，广东 清远 511517；2.广东静脉脂肪乳工程中心，广东 清远 511517）

鱼油在防治冠心病、高血压、糖尿病、关节炎等疾病，以及自身免疫性病变和癌症中有重要作用，具有极高的营养和临床价值。鱼油中的脂肪酸成分有EPA（二十二碳六烯酸）、DHA（二十碳五烯酸）、棕榈酸（palmitic acid）、油酸（oleic acid）、9-十六碳烯酸（palmitoleicacid）、肉豆蔻酸（myristic acid）、花生四烯酸（arachidonic acid）、亚油酸（linoleic acid）、亚麻酸（alpha-linolenic acid），其中主要成分DHA和EPA是人体必需的不饱和脂肪酸[1-2]。

EPA和DHA主要有游离型、乙酯型和甘油酯型3种形式。研究结果显示，EPA和DHA乙酯在人体中消化和吸收比较困难，可能存在安全隐患，游离型的EPA和DHA容易氧化生成对人体有害的物质，口感不好，直接食用难以被接受。甘油酯型性质稳定、不易氧化，而且口感好，易被人体消化吸收[3]。天然鱼油一般以EPA和DHA甘油酯的形式存在，含量较低，目前广泛应用于乳制品、保健食品和医药产品中的是经精制的富含EPA和DHA甘油酯的鱼油。

德国贝朗（B.Braun）公司开发的鱼油中/长链脂肪乳注射液（商品名力保鱼优，Lipoplus），2004年在欧洲上市，2014年在国内上市。该产品采用中链甘油三酸酯、大豆油和ω-3精制鱼油组合，具有炎症调节作用及减少感染和并发症的作用。当口服或肠内营养不足、有禁忌或无法进食时，本品作为肠外营养的组成部分，提供包括人体必需ω-6、ω-3脂肪酸在内的脂肪。目前国内已有两个厂家仿制力保鱼优的产品并获得批准上市，还有费森尤斯卡比生产的含精制鱼油的多种油脂肪乳注射液（C6～24）。含鱼油的脂肪乳注射液在临床上越来越受到重视，可为机体提供必需的能量和代谢底物。此外，还可通过抑制炎症反应增加机体免疫力、改善防御能力、减轻氧化应激、维护胃肠功能与结构和促进机体康复，拓展了其治疗临床危重症的新途径[4-5]。

本文测定的鱼油脂肪乳注射液参考力保鱼优，以中链三酰甘油、大豆油和ω-3鱼油为主药。其中ω-3鱼油为甘油酯型鱼油，中链甘油三酸酯的主要成分为辛酸甘油酯和癸酸甘油酯，大豆油主要含油酸甘油酯、亚油酸甘油酯、亚麻酸甘油酯。本文研究的目的是同时测定鱼油脂肪乳注射液的主要三酰甘油。直接测定三酰甘油的分析方法主要有高碘酸法、柱层析法、酶法、薄层色谱法（TLC）、气相色谱法、高效液相色谱法等，其中化学法、柱层析法易出错、操作步骤多、耗时长。酶法容易使甘油酯水解，导致脂肪酸位置鉴定困难。

目前仪器分析法是较为常用的方法[6]，有气相色谱法[7-8]、液相色谱法[9]、气相色谱-质谱联用法[10]、液相色谱-质谱联用法[11]、红外光谱法[12]等。其中高效液相色谱法多以甲醇-水、乙腈-水等为流动相体系，EPA甲酯和DHA甲酯的峰形对称性较差，与相邻色谱峰难以有效分离。因脂肪酸甲酯的紫外吸收较弱，选择220 nm为检测波长，基线噪音大，干扰峰较多，不适合多组分甲酯的测定[6]。质谱法成本较高，红外光谱法难以准确定量，而三酰甘油沸点较高，气相色谱法也很难直接测定。因此目前多以气相色谱法测定脂肪酸甲酯表征对应三酰甘油的含量[13-20]。本文的研究中均以脂肪酸甲酯代替三酰甘油，建立可批量检测、操作简便、色谱分离完全、专属性好的气相色谱检测方法，测定各脂肪酸甲酯，再计算三酰甘油的含量。

1 仪器与试药

7820A气相色谱仪（美国安捷伦公司），BT125D电子天平（德国赛多利斯公司），AUW220D电子天平（岛津仪器有限公司）。

三氯甲烷、甲醇、无水氯化钙均为分析纯，采购自广州化学试剂厂；正己烷采购自Honeywell，甲醇钠（批号SHBC0411V）、2，6-二叔丁基甲基苯酚（以下简称BHT，批号P500117）、十七烷酸甲酯（批号BCBL1383V，纯度99.7%）、辛酸甲酯（MKBN2148，纯度99.9%）、癸酸甲酯（BCBS2886V，纯度99.6%）、亚油酸甲酯（BCBG7530V，纯度99.7%）、EPA甲酯（BCBL3641V，纯度99.6%）、DHA甲酯（BCBL9396 V，纯度99.6%），辛酸三酰甘油（BCBJ7208V，纯度99.6%）、癸酸三酰甘油（SLBB6226V，纯度100%）、亚油酸三酰甘油（SLBB9084V，纯度98.0%）均采购自Sigma。鱼油脂肪乳注射液（批号：15-1，15-2，15-3，广东嘉博制药有限公司），规格是250 mL∶50 g油脂∶3 g磷脂。原研药（批号：120578083，德国贝朗）。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；FID检测器温度为275℃；进样口温度为260℃；载气：高纯氮气（纯度＞99.99%），载气流速：1 mL/min；分流比：10∶1；进样量：1 μL。升温程序：起始温度为60℃，维持1 min，以每分钟20℃的速率升至180℃，再以每分钟4℃的速率升至240℃，保持18 min。

2.2 稀释剂

取BHT约75 mg，精密称定，溶于1 000 mL三氯甲烷和500 mL甲醇的混合溶液中，得到稀释剂。

2.3 内标溶液的制备

取十七烷酸甲酯约100 mg，精密称定，于50 mL容量瓶中，加入稀释剂溶解并稀释至刻度，得到内标储备液（2 mg/L）。精密量取上述溶液10 mL，至100 mL量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，作为内标溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密量取鱼油脂肪乳注射液100 μL，至20 mL容量瓶中，加入稀释剂溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液与内标液各1 mL，至具塞试管中，混匀，得到溶液A。在通氮气的环境下，蒸干溶液A的溶剂，得到残渣。

将上述残渣溶于2 mL正己烷中，加入100 μL甲基化试剂（将1 mL甲醇钠溶液于1.7 mL甲醇中），混匀并剧烈振荡。放置30 min，加入约100 mg无水氯化钙，摇匀并过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.5 混合对照品溶液的制备

分别取约120 mg辛酸三酰甘油，80 mg癸酸三酰甘油，90 mg亚油酸三酰甘油，16 mg EPA甲酯和11 mg DHA甲酯，精密称定，至20 mL容量瓶中，加入稀释剂溶解并定容，得到5种对照品储备液。精密量取上述溶液各1 mL，置同一20 mL容量瓶中，加入内标储备液2 mL，用稀释剂稀释至刻度，得到混合对照品溶液A。取1 mL此溶液，按照“2.4项下”，从“在通氮气的环境下”开始同法操作，得到混合对照品溶液。

2.6 单个对照品溶液的制备

取“2.5”项下对照品储备液各1 mL，分别置20 mL容量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，得到5种对照品溶液。取1 mL上述溶液与1 mL内标溶液，按照“2.4项下”供试品溶液，从“在通氮气的环境下”开始同法操作，制备单个对照品溶液。

2.7 峰定位溶液的制备

另取辛酸甲酯、癸酸甲酯、亚油酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯适量，加入稀释剂溶解，作为峰定位溶液。

2.8 空白溶液的制备

取稀释剂1 mL，加入1 mL内标溶液，按照“2.4”项下，从“在通氮气的环境下”开始同法操作，制备空白溶液。

2.9 计算公式

式中：A对s为对照品溶液中待测物的峰面积；C对s为对照品溶液待测物的浓度；A内s为对照品中内标的峰面积；C内s为内标的浓度。

式中：f为校正因子；C内i为供试品溶液中内标的浓度；Ai为供试品溶液中待测组分的峰面积；A内i为供试品溶液中内标的峰面积；a为换算系数[M三酰甘油/（3×M甲酯）]；M三酰甘油为三酰甘油型化合物的分子量（EPA三酰甘油=945.6/DHA三酰甘油=1023.6）；M甲酯为甲酯型化合物的分子量（EPA甲酯=316.5/DHA甲酯=342.5）。

注：测定辛酸三酰甘油、癸酸三酰甘油和亚油酸三酰甘油的对照品均是三酰甘油对照品，计算时不需要换算系数，200为供试品的稀释倍数。

3 方法学验证内容

3.1 专属性

取空白溶液、供试品溶液、混合对照品溶液、单个对照品溶液和峰定位溶液进样，记录色谱图。

结果显示：稀释剂不干扰主成分峰的测定，供试品溶液中的各目标组分色谱峰能与单个对照品的色谱峰的保留时间一致。供试品溶液色谱图中，目标组分色谱峰与相邻色谱峰分离度不小于1.5。

3.2 线性和范围

取“2.5”项下各对照品储备液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置同一20 mL容量瓶中，加入内标储备液2 mL，用稀释剂稀释至刻度。精密量取上述溶液1 mL，按“2.4”项下，从“在通氮气的环境下”开始同法操作，得到系列浓度的混合对照品溶液，注入色谱仪。以浓度为横坐标，各组分与内标峰面积比为纵坐标，得到线性回归方程和相关系数。结果显示，各对照品组分在各浓度范围内线性关系良好。

3.3 进样重复性

取“2.4”项下制备的供试品溶液，连续进样6针，以峰面积计算RSD值，结果见表2。结果显示，进样6针各脂肪酸甲酯的峰面积RSD＜1.0%，进样重复性良好。

表2 进样重复性Table 2 Repeatability of injections

3.4 重复性

按“2.4”项下方法，制备6份供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图，计算各甘油三酸酯含量和RSD，结果见表3。结果显示，6份供试品中各三酰甘油的含量RSD＜1.5%，供试品测定重复性良好。

表3 重复性结果Table 3 Results of reproducibility ρ/（g·L-1）

3.5 中间精密度

由不同的实验员在不同的日期，按“3.4”项下测定本品各三酰甘油含量，计算RSD。结果见表4。结果显示，不同实验人员测定各三酰甘油含量的RSD均小于2.0%，方法精密度良好。

表4 中间精密度结果Table 4 Results of intermediate precision（n=12） ρ/（g·L-1）

图1 各溶液色谱图Figure 1 Chromatograms of solutions

表1 线性试验Table 1 Linear test ρ/（g·L-1）

3.6 回收率

取约150 mg辛酸三酰甘油，100 mg癸酸三酰甘油、112 mg亚油酸三酰甘油、20 mg EPA甲酯、14 mg DHA甲酯置同一50 mL量瓶中，精密称定，加稀释剂溶解并稀释至刻度，得到对照品储备液。

精密量取鱼油脂肪乳注射液0.25 mL，共9份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入上述对照品储备液3、5、7 mL（每个浓度制备3份溶液），用稀释剂稀释至刻度。得到相当于供试品浓度80%、100%、120%的溶液。分别精密取1 mL上述溶液和1 mL内标溶液，按照“2.4”项下同法处理。所得溶液注入色谱仪，记录色谱图，计算回收率和RSD。结果见表5，三酰甘油的平均回收率在99.4%～100.2%之间，RSD在1.3%～4.4%之间，方法的准确度良好。

表5 回收率试验结果Table 5 Results of recoveries

3.7 检测限和定量限

取混合对照品溶液，通过逐级稀释后进样，使目标化合物峰信噪比值约为10∶1，作为定量限浓度。确定浓度后连续进样6针，计算保留时间RSD。使目标化合物峰信噪比值约为3∶1，作为检测限浓度。结果见表6。

表6 定量限和检测限结果Table 6 Results of LOQ and LOD

3.8 耐用性

3.8.1 供试品溶液稳定性取供试品溶液，分别于0、4、8、16、24、48 h进样，以各脂肪酸甲酯与内标的峰面积比值计算RSD。结果见表7，供试品溶液放置48 h，峰面积比值RSD均小于1.0%，供试品溶液放置48 h稳定性良好。

表7 供试品溶液稳定性结果Table 7 Results of solution stability

3.8.2 色谱条件变化取供试品溶液和混合对照品溶液，起始柱温变化±5℃、载气流速变化±20%，分别测定各三酰甘油的含量。结果见表8，起始柱温变化±5℃、载气流速变化±20%，对测定结果未见显著影响。各三酰甘油的含量RSD均小于1.5%，方法耐用性良好。

表8 耐用性结果Table 8 Results of robustnessρ（/g·L-1）

3.9 样品测定

取本品3批和原研药一批，按照“2试验方法”项下，分别测定各三酰甘油的含量，结果见表9。结果显示自研制剂的含量不低于原研药，且符合本品拟定的内控标准规定：本品含中链三酰甘油（辛酸三酰甘油+癸酸三酰甘油）应为95.0～105.0 g/L，含大豆油（按亚油酸三酰甘油计）不得低于40 g/L，含EPA三酰甘油（C20∶5n-3）和DHA三酰甘油（C22∶6n-3）含量之和不得低于11.0 g/L。

表9 样品测定Table 9 Determination of samples ρ/（g·L-1）

4 讨论

鱼油富含ω-3多不饱和脂肪酸和三酰甘油，制备鱼油注射液的油相多为大豆油、棕榈油、卵磷脂等油脂类，油脂的主要成分为三酰甘油。气相色谱法适合大多数的脂肪和脂肪酸，先把脂肪中的三酰甘油进行水解得到脂肪酸，脂肪酸经甲酯化得到脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯在FID检测器和质谱检测器上响应好，峰型对称，塔板数高[13-14]。如果脂肪类样品甲酯化不完全，样品中可能会残留三酰甘油、二酯和单酯，进入气相色谱柱容易沉积在固定液表面，降低色谱柱的柱效。因此需要选择方便、快捷的甲酯化方法。常用的甲酯化方法为酸催化和碱催化[15-18]，包括三氟化硼甲醇法[21]、盐酸甲醇法[22]、氢氧化钠甲醇法[23]、乙酰氯甲醇法[24]。本文分别使用氢氧化钾-甲醇，硫酸-甲醇加热回流和甲醇钠等方法进行试验，对甲酯化效果进行比较，最终确定了以甲醇钠作为甲酯化试剂，操作简便，确保三酰甘油和脂肪酸全部转化为甲酯。

本品经甲酯化后得到的亚油酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯含双键，EPA和DHA分别含有4个和5个活泼的亚甲基，此类亚甲基的存在使二者极易受到光、氧、高温、自由基及金属元素的影响，产生氧化、酸败、聚合、双键共轭等化学反应[19]。甲酯化过程需要经过水浴蒸干溶剂、甲基化反应、过滤等一系列操作，因此需要在样品溶液中加入抗氧化剂保护不饱和脂肪酸。本研究参考欧洲药典（EP）通则[20]选择的BHT抗氧化能力强，在有机溶剂中的溶解性较好，在样品处理中能有效防止不饱和脂肪酸的氧化。

本处方的辅料为磷脂、甘油、氢氧化钠、水，以上辅料除卵磷脂可能含少量三酰甘油（不多于3%），蛋黄卵磷脂的处方量为1.2%，综合评估均不干扰主成分的测定，因此本研究没有做辅料干扰试验。

本文采用直接进样毛细管柱气相色谱法测定鱼油脂肪乳注射液中三酰甘油的含量，结果表明线性关系良好，方法重现性好，平均回收率在99.4%～100.2%之间，回收率高，可更好地进行产品的质量控制。