参地颗粒对膜性肾病大鼠肾脏内质网应激及足细胞自噬的干预作用

魏 玲，金 华，王亿平

(安徽中医药大学第一附属医院肾内科，安徽 合肥 230031)

膜性肾病是一组由免疫复合物介导的足细胞病变，临床表现为大量蛋白尿，为肾病综合征常见的病理类型之一[1]。膜性肾病传统治疗为激素联合免疫抑制剂，但部分患者出现感染、股骨头坏死、肝肾毒性、肿瘤等严重不良反应[2]，且病情不易控制或反复，最终进展至终末期肾病，对患者生活质量造成严重影响。探索膜性肾病的发病机制和治疗方法已成为临床研究的重点。近年来研究发现，持续的内质网应激是足细胞损伤的重要因素，而自噬对内质网应激介导的足细胞损伤具有保护作用，该机制有望成为防治足细胞病变的重要途径[3-4]。中医药治疗膜性肾病体现出一定的优势，既往研究[5-6]证实参地颗粒在治疗肾小球疾病中已取得显著疗效，并有研究[7]表明参地颗粒可有效调节自噬的活性。大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin，C-BSA)是制作膜性肾病的经典模型。本研究将进一步观察参地颗粒对C-BSA致肾病大鼠肾脏内质网应激及足细胞自噬的干预作用，从而探讨其治疗膜性肾病的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 2月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，购自安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可号：SCXK(鲁)2019-0003]，适应性喂养1周。

1.2 实验药物与试剂 参地颗粒(皖药制字BZ20080025，由人参、熟地黄、茯苓、五味子、桑螵蛸、鸡内金、川芎组成，颗粒剂每袋10 g，含生药34 g)：安徽省中医院制剂中心研制。缬沙坦胶囊(国药准字H20040217，每片80 mg)：北京诺华制药有限公司。C-BSA(批号725M036)：北京索莱宝科技有限公司。弗氏不完全佐剂(F5506，批号SLBL9742V)：Sigma公司。尿蛋白浓度测定试剂盒(批号20201204)：南京建成公司。

2 方法

2.1 模型复制及分组 采用单纯随机抽样法将40只大鼠随机分为正常组、模型组、参地颗粒组、缬沙坦组，每组10只。除正常组外，其余30只大鼠均采用尾静脉注射C-BSA建立膜性肾病模型[8]。预免疫：取C-BSA 100 mg溶解于生理盐水15 mL中，与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化。每只大鼠取混合液1 mL，在双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：按照16 mg/kg尾静脉注射C-BSA，每周3次，连续4周。用代谢笼中收集的大鼠24 h尿液进行尿蛋白检测，24 h尿蛋白(24-hour urine protein,24hUPro)量≥20 mg视为模型复制成功，<20 mg者予以剔除。正常组大鼠以相同的注射方式注射等容积生理盐水。

2.2 给药方法 正常组、模型组每日均给予10 mL/kg 生理盐水灌胃；参地颗粒组每日给予4.0 g/kg参地颗粒水溶液灌胃，灌胃方法和剂量参照《中药药理研究方法学》相关章节[9]计算得出；缬沙坦组每日给予20 mg/kg缬沙坦胶囊混悬液灌胃。每日1次，每次3 mL，连续给药8周。

2.3 标本采集及检测方法 给药8周后，用代谢笼收集大鼠24 h尿液，采用比色法测定尿蛋白浓度(24hUPro量=尿蛋白浓度×24 h尿量)。再用2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右侧肾脏放入冻存管内，投放到液氮中，再转入-80 ℃超低温冰箱保存，以备Western blot检测。

Western blot检测方法：取100 mg肾组织加入1 mL组织裂解液及蛋白酶抑制剂制备组织匀浆，10 000 r/min离心40 min，收集上清液，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。100 ℃变性10 min，每组取等量蛋白质经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移到PVDF膜上。10%脱脂奶粉-TBST溶液室温封闭4 h后，置入加有一抗[一抗稀释比例：葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、人内质网应激相关蛋白(human endoplasmic reticulum stress-related protein，CHOP)为1∶500；Nephrin、Podocalyxin、微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)、Beclin1为1∶1 000；β-actin为1∶1 000]的10%奶粉-TBST，4 ℃冰箱孵育过夜；次日用TBST漂洗后加入HRP标记的二抗(稀释比例为1∶1 000)，室温孵育2 h；TBST漂洗，加入增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)后曝光；用Fluors凝胶成像系统分析蛋白条带，蛋白的相对表达水平以目的蛋白光密度与β-actin条带光密度的比值表示。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状况 正常组大鼠活动正常，反应灵敏，毛色光亮，饮食正常，体质量增加；模型组大鼠精神和毛发光泽度均较差，毛发脱落，摄食减少，尿量增多，大便稀，部分大鼠出现腹部皮下水肿。参地颗粒和缬沙坦组大鼠的精神状态、毛发、饮食、二便等情况均有改善。模型复制期间，有10只大鼠死亡，其中2只为C-BSA溶液过量所致，1只为尾静脉注射过程中当场死亡，4只为尾静脉注射次数过多，愈合不良，感染死亡；另外3只在模型后期死亡，为个体体质较差不耐受所致。治疗期间，有3只大鼠死亡，其中正常组死亡2只，为灌胃不当，误入气管致死；模型组大鼠死亡1只，原因不明。

3.2 各组大鼠24hUpro含量比较 模型组大鼠24hUPro含量显著高于正常组(P<0.05)。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠24hUPro含量显著降低(P<0.05)，且参地颗粒组大鼠24hUPro含量显著低于缬沙坦组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠24hUpro含量比较

3.3 各组大鼠肾脏中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠肾组织中GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相对表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著升高，Nephrin、Podocalyxin蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠肾组织中GRP78、CHOP表达水平均显著降低，而Nephrin和Podocalyxin表达水平则显著升高(P<0.05)；与模型组比较，参地颗粒组Beclin1表达水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.05)，而缬沙坦组升高不显著(P>0.05)；且参地颗粒组GRP78、CHOP表达水平均显著低于缬沙坦组(P<0.05)，参地颗粒组Podocalyxin、Beclin1表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著高于缬沙坦组(P<0.05)。见图1、表2。

3.4 透射电子显微镜观察肾小球变化 正常组大鼠的肾小球足细胞结构清楚，未见足突融合，基底膜均匀且未见增厚，上皮下未见电子致密物形成；足细胞内可见少量自噬小体形成。模型组大鼠的足突可见大部分融合或消失，基底膜弥漫性增厚，上皮下可见大块电子致密物沉积；足细胞内自噬小体数量较正常组增多。参地颗粒组和缬沙坦组大鼠的肾小球足突融合程度较模型组减轻，基底膜轻度增厚，伴有少量电子致密物沉积；参地颗粒组大鼠的足细胞内自噬小体数量与模型组比较明显增多，而缬沙坦组大鼠的足细胞内自噬小体数量与模型组大致相当。见图2。

注：A.正常组；B.模型组；C.参地颗粒组；D.缬沙坦组

表2 各组大鼠肾脏GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/L3-Ⅰ蛋白表达水平比较

注：A.正常组；B.模型组；C.缬沙坦组；D.参地颗粒组；红色箭头示自噬小体

4 讨论

膜性肾病发病的核心环节是足细胞的病变[10]。足细胞是一种位于肾小球基底膜外侧的终末分化细胞，而足细胞及相邻足细胞足突之间的裂孔膜构成蛋白等滤过的最后一道屏障。足细胞缺乏再生能力，因此足细胞的损伤或凋亡是导致肾小球疾病进展直至走向终末期肾病的主要原因。内质网是一种维持细胞内环境稳定的细胞器，在缺血、低氧、氧化应激等应激状态下，内质网环境被破坏，从而导致未折叠蛋白的积累，称为内质网应激[11]。足细胞含有丰富的内质网系统，内质网应激是膜性肾病重要的发生机制之一，适度的内质网应激是细胞应对外界刺激的保护机制，但发生在肾组织内持续或过强的应激反应是诱导足细胞损伤或凋亡的机制之一[3]。在这种病理环境中，细胞通常通过形成自噬体清除受损蛋白及细胞器来进行损伤修复[12]。与肾脏其他固有细胞相比，足细胞可维持较高自噬活性[13]，因此,足细胞损伤与自噬能力下降密切相关。在内质网应激条件下，当足细胞受到损伤时会即刻启动自噬功能，以减轻内质网应激对足细胞造成的损伤，维持足细胞正常的结构和功能[3]。

GRP78、CHOP是内质网应激的关键因子。GRP78是一种位于内质网中的葡萄糖调节蛋白，参与蛋白质在内质网中的糖基化修饰，在发生内质网应激时明显增多，故可作为内质网应激的标志性蛋白[14]，其表达水平反映了细胞应激的严重程度。CHOP是内质网应激信号通路下游重要的促凋亡因子，在内质网应激诱导的细胞凋亡和细胞损伤中具有重要作用，是内质网应激诱导多种细胞产生调亡的关键信号分子[15]。内质网应激诱导细胞凋亡通路可以增加CHOP基因的表达水平。本研究发现，作为膜性肾病的经典动物模型，C-BSA大鼠肾组织中GRP78、CHOP蛋白表达水平上升，而足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin表达水平降低，提示C-BSA大鼠出现内质网应激及足细胞损伤。

LC3是自噬的重要标志，当自噬发生时，LC3从Ⅰ型(LC3-Ⅰ)转换为Ⅱ型(LC3-Ⅱ)[16]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以作为鉴定自噬活性的指标。Beclin1是自噬起始的重要调节因子，其表达水平可直接反映自噬活性[17]。本研究发现，C-BSA大鼠肾组织中Beclin1表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著上升，提示自噬被激活，这可能为足细胞损伤后所诱导的保护性反应；增强自噬活性可减轻内质网应激及足细胞损伤，而抑制自噬活性可促进上述损伤效应。

近年来研究发现，中医药在调节免疫功能、减少免疫抑制剂所带来的代谢紊乱和免疫力下降等方面有独特的作用。膜性肾病是慢性肾炎的主要病理类型，其基本病机是脾肾亏虚、精微下注[18]。参地颗粒是根据清朝新安医学名家程林所著《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》中的人参汤化裁而成，功效为健脾益肾、固摄精微。前期研究[19]显示，该方能够通过降低炎症因子释放和抑制炎症反应，具有改善慢性肾炎患者的临床症状，减轻蛋白尿等作用。且近期研究[19-20]已证实其对慢性肾炎患者和模型大鼠的免疫功能紊乱具有一定调节作用。血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂是目前治疗膜性肾病蛋白尿的主要药物。现代药理学研究[21]发现，缬沙坦是一种细胞周期性药物，能抑制细胞增殖活性，对抗原敏感性小淋巴细胞发挥非特异性杀伤作用，能改善肾小球内毛细血管滤孔状况，从而减少蛋白排出，发挥肾脏保护作用。故本研究采用缬沙坦作为阳性对照药物。

本研究进一步发现，参地颗粒具有减轻C-BSA大鼠的足细胞损伤及蛋白尿作用，并且能够增强自噬活性，抑制过度的内质网应激反应，进而发挥对足细胞的保护性作用。但是其具体作用机制仍有待于进一步研究。