酸性乳糖酶活测定及对奶粉中 乳糖水解条件的研究

何爱红，李雪飞,王义哲，赵喜红

（1.北京世纪盛名医学科技有限公司，北京 100000；2.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205）

乳糖在乳糖酶的作用下能被分解为半乳糖和葡萄糖。母乳中的乳糖是婴幼儿的重要能量来源，其被分解的半乳糖对婴幼儿智力发育尤为重要。当人体乳糖酶缺乏或乳糖酶活性较低时，乳糖不能被完全消化吸收，会引起肠道气多、肠鸣、腹胀腹痛或非感染性腹泻等消化道症状，称之为乳糖不耐受症，这在很大程度上影响了乳制品营养成分吸收和市场普及。据相关研究显示，中国人的乳糖不耐受症在全世界范围内处于高位趋势，乳糖酶缺乏发生率在80%～95%[1]。由于乳糖不耐症，有很多人无法充分利用牛乳，这对牛乳的生产及消费的增长具有较大的阻碍作用。

乳糖酶按国际酶学委员会的命名法，称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称β-半乳糖苷酶。乳糖酶可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖的混合物。乳糖酶广泛用于食品工业，特别是乳品工业，在牛奶中添加乳糖酶可水解乳糖，缓解乳糖不耐受症，提高乳糖的消化吸收利用率。

惠华英等[2]认为检测乳糖酶活性是临床诊断乳糖酶缺乏症的常用手段。乳糖酶活性定量检方法主要有小肠黏膜活检法、ONPG试验法（1950年Seidman和Link制备出了邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷）、稳定同位素法、高效液相色谱法及粪便还原糖测定法。不同的酶原，乳糖酶水解特性、缓冲体系以及pH值不同。美国《食品化学法典》（5版）[3]中,乳糖酶活性的测定方法分为中性乳糖酶活性测定方法和酸性乳糖酶活性测定方法。赵华梅等[4]比较了《食品化学法典》（5版）和《酶应用手册》中测定乳糖酶活性的方法，参照美国食品药品法典第五版，对国内外测定条件进行了逐项实验的研究，建立了乳糖酶活力测定的方法。

本文参照美国食品药品法典第五版选用酸性乳糖酶活性测定方法测定了产品中酸性乳糖酶的酶活性，然后分析了市售两款奶粉中的乳糖在不同温度、不同水解时间、不同的pH值环境中的乳糖分解率，探讨了该乳糖酶在体外模拟条件下分解乳糖的最优条件。期望通过探讨最优乳糖分解条件，能为通过外加酸性乳糖酶缓解乳糖不耐受的消费者提供更科学的食用方法指导，提高所摄入的奶液中的乳糖消化吸收利用率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品为儿歌乳糖酶水解蛋白调制乳粉，由北京世纪盛名医学科技有限公司提供。

1.2 试剂

2-硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG）、邻硝基苯酚（ONP），分析纯，上海阿达玛斯公司。

1.3 仪器设备

可见分光光度计v-5100，上海元析仪器有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；智能数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；精密pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 酶活力测定试剂配制

①邻硝基苯酚溶液（2.0 mmol·L-1）：取139.0 mg邻硝基苯酚，置于500 mL容量瓶中，用10 mL的95%酒精溶解涡旋，再用1%碳酸钠溶液稀释至刻度线。②底物溶液：取370.0 mg的2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷，置于100 mL容量瓶中，加50 mL醋酸缓冲液涡旋溶解，稀释至刻度线。

1.4.2 乳糖标准储备液配制

①乳糖标准贮备液（20 mg·mL-1）：称取在95 ℃烘箱中干燥2 h的乳糖标样2 g（精确至0.1 mg），溶于水中，用水稀释至100 mL容量瓶中；②乳糖标准工作液：分别吸取乳糖标准贮备液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。配成乳糖标准系列工作液，浓 度 分 别 为0 mg·mL-1、1 mg·mL-1、2 mg·mL-1、 3 mg·mL-1、4 mg·mL-1和5 mg·mL-1。

1.4.3 酶活力测定

酶活力测定按照美国食品药品法典第五版酸性乳糖酶活性测定方法，步骤如下。

（1）标准曲线绘制。选用合适的分光光度计，将波长调整至420 nm处，分别测定0.10 mmol·L-1、 0.14 mmol·L-1、0.18 mmol·L-1和0.22 mmol·L-1邻 硝基苯酚的吸光值。

（2）检测样品。吸取2.0 mL的底物液置于 25 mm×150 mm的干净试管中，在37 ℃水浴平衡 10 min，然后迅速吸取0.5 mL待测样品和空白水对照组加入平衡好的底物中，快速涡旋1 s，立即将试管放回水浴。反应15 min后取出迅速加入10%碳酸钠2.5 mL，涡旋终止反应，加水至25 mL， 混匀。

（3）用水作为空白校准调零仪器，将样品转移至玻璃皿中，在420 nm处测定吸光值和空白样品的吸光值，并取其平均值，酶活力计算公式为

式中：OD420为样品反应后，在420 nm处的平均吸光度；n为稀释倍数；4.6为标准曲线斜率； 15为反应时间；0.5为样液体积；w为样品质量，g。

1.4.4 奶粉中乳糖含量的测定

乳糖含量测定严格按照国标GB 5413.5—2010中高效液相色谱法测定食品中乳糖，步骤如下。

（1）试样处理。称取固态试样1 g或液态试样2.5 g（精确到0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加15 mL 50～60 ℃水溶解，于超声波振荡器中振荡10 min，用乙腈定容至刻度，静置数分钟，过滤。取5.0 mL过滤液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，通过0.45 µm滤膜过滤，滤液供色谱分析。

（2）色谱柱条件。色谱柱：Shodex NH2P-50-4E， 4.6 mm×250 mm，5 µm；流动相∶乙腈∶水=70∶ 30；流 速：1 mL·min-1；柱 温：35 ℃；进 样 量： 10 µL；示差折光检测器条件：温度：35 ℃；蒸发光散射检测器条件，飘移管温度：70 ℃；气流量： 320 KPa；撞击器：关。

（3）标准曲线的制作。将乳糖标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准工作液的浓度为横坐标绘制标准曲线。

（4）样品检测。将试样溶液注入高效液相色谱仪中，测定峰面积或峰高，从标准曲线中查得试样溶液中的乳糖浓度。

（5）乳糖含量计算。乳糖含量的计算公式为

式中：X为试样中糖的含量，g/100 g；c为样液中糖的浓度，mg·mL-1；V为试样定容体积，mL；n为样液稀释倍数；m为试样的质量，g。

1.4.5 乳糖水解率的测定与酶解条件优化

利用高效液相色谱法测定乳糖酶水解反应前后奶粉中乳糖的含量变化，计算乳糖分解效率，其高效液相法操作参照1.4.4。①取4平勺奶粉（每平勺奶粉约4.3 g），加入120 mL水冲调，搅拌均匀。②利用高效液相色谱法测量冲调后的牛奶中的乳糖含量，并做好记录。③向牛奶中加入一包儿歌乳糖酶（每包含量1.5 g）并搅拌均匀。④取5支试管分别加入5 mL混合液，分别测定40 ℃、45 ℃、 50 ℃、55 ℃和60 ℃下的乳糖分解效率，设置pH为7，酶解时间为10 min，确定最优酶解温度。⑤确定最优酶解温度后，另取5支试管分别加入5 mL混合液。在最优酶解温度下，依次酶解10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min和240 min测定分解效率，确定最优酶解时间。⑥在最优酶解温度和时间条件下，取5支试管，分别设置pH为4、5、6、7和8，测定乳糖分解效率，确定最优pH值。

2 结果与分析

2.1 乳糖酶活力测定结果

由图1可知，乳糖酶标准曲线为y=4.600 6x，其中R2=0.999 9，斜率为4.600 6。随机挑取5个不同批次的商品化乳糖酶产品，测定所含酸性乳糖酶的酶活力。结果表明，5批次乳糖酶的酶活分别为 6 818 ALU·g-1、7 332 ALU·g-1、7 050 ALU·g-1、 7 441 ALU·g-1和8 050 ALU·g-1。乳糖酶活力稳定，且最大酶活力值为8 050 ALU·g-1。

图1 乳糖酶活力测定标准曲线

2.2 奶粉中乳糖测定结果

由图2可知，乳糖测定标准曲线为y=3.03×106x-1.35×106，R2=0.998 4，具有良好的线性关系。

图2 乳糖测定标准曲线

2.3 乳糖酶水解率单因素优化

2.3.1 酶解温度优化

由图3可知，乳糖酶在40 ℃、45 ℃和50 ℃时，乳糖酶水解效率逐渐增加，由55%提升至60%，酶解效率升高较明显；乳糖酶在55 ℃时，酶解效率最高，为64%；超过55 ℃后，由于酶受热超过阈值，导致蛋白质结构出现损坏，使酶解效率大幅降低；当酶解温度升高至60 ℃时，酶解效率降至34%。

图3 不同酶解温度下的乳糖酶水解效率

2.3.2 酶解时间优化

由图4可知，当酶解时间为10 min时，酶解效率最低为54%，240 min时乳糖酶水解效率最高为88%。总体趋势表现为随着酶解时间的增加，酶解效率也在正向增加，酶解时间与酶解效率呈正比关系。在酶解时间为20～120 min时，酶解效率提升速率最快，超过120 min后，酶解效率提升趋势逐渐变缓，这可能与酶活衰减有关，所以最优酶解时间为 120 min。

图4 不同酶解时间下的分解效率

2.3.3 酶解pH值优化

在酶解温度55 ℃，酶解时间120 min的条件下探究最优pH值，结果见图5。由图5可知，在pH值为4时，乳糖酶对奶粉中的乳糖表现出了较好的水解效率，达91%；当pH值升至5时，酶解效率降低为89%，pH为6时，乳糖的水解效率为90%。当酶解pH值超过6时，酶解效率出现了显著性下降，总体趋势表现为pH与酶解效率呈负相关。因此，当酶解pH为4时，该乳糖酶分解乳糖的效率最佳。

图5 不同pH值对酶解效率的影响

3 结论与讨论

（1）乳糖酶的水解效率在55 ℃时迎来拐点，温度较低和温度过高时均不利于乳糖酶发挥作用。温度偏低，乳糖酶不能发挥最高效的分解能力，在40～55 ℃时，酶解效率由55%提升到了64%。当温度为55～60 ℃时，乳糖酶的分解效率由64%降低至34%，出现了明显下降，说明超过55 ℃后不利于乳糖酶的作用发挥，而本研究这一结果与黄磊的实验结果相似[5]，这可能与温度过高导致酶出现失活效应有关。

（2）在乳糖酶活力测定的众多方法中，高效液相色谱法虽然费用高，但精确度最高。此外，乳糖酶的稳定性是本实验3因素优化条件探讨的前提保障。实验表明，本文选用的5个不同批次的乳糖酶产品的酶活力具有较好的稳定性，且最高酶活力为 8 050.00 ALU·g-1。另外，本次实验用的奶粉属市场随机购买，虽然市场上奶粉品牌覆盖率有限，批次也仅仅是一个品牌的一个批次，但通过测试奶粉中所含乳糖的含量得知，所购奶粉中碳水化合物含量在其标识范围内，选用的乳糖酶也是市场成熟产品，实验探讨的乳糖酶用量、乳糖酶的水解条件对消费者的理性消费有一定指导意义。指导消费者选用合适的乳糖酶，科学地使用乳糖酶，进而满足乳糖不耐症对奶制品的消费需求，持续增强消费者对含乳糖的奶制品的消费舒适度，有助于多方位满足社会公众对优质蛋白的摄入需求。β-半乳糖苷酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1～4个半乳糖，生成低聚半乳糖（Galactooligosaccharide，GOS）[6]。因受限于GOS的测试条件，本实验没有测定酶解反应后体系中是否有GOS生成。此外，乳糖的水解率较低的原因以及乳糖酶是否发挥了半乳糖苷的转移作用，需要进一步探讨。