基于HPLC多指标成分测定及指纹图谱多模式识别的不同产地不同品种当归质量差异分析

张明惠，朱田田, 2, 3*，晋 玲, 2, 3，王富胜，徐 丽，康舒淇

基于HPLC多指标成分测定及指纹图谱多模式识别的不同产地不同品种当归质量差异分析

张明惠1，朱田田1, 2, 3*，晋 玲1, 2, 3，王富胜4，徐 丽1，康舒淇1

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃 兰州 730000 3. 甘肃省珍稀中药资源评价与保护利用工程研究中心，甘肃 兰州 730000 4. 定西市农业科学研究院，甘肃 定西 743000

建立当归的HPLC指纹图谱并测定其主要有效成分的含量，结合多种化学计量学分析，确定不同产地不同品种（岷归1号、岷归2号）当归差异成分，为当归药材质量控制提供参考。采用HPLC法建立不同品种当归的指纹图谱，并对指标成分进行含量测定。采用相似度评价、聚类分析（cluster analysis，CA）、因子分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）、Fisher 线性判别分析进行数据分析。HPLC指纹图谱共标定了不同品种当归中的16个共有峰，指认出绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、洋川芎内酯 A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞8个色谱峰。岷县产区当归的2个品种当归间存在差异的成分是绿原酸（＜0.01）、洋川芎内酯I（＜0.01）、洋川芎内酯H（＜0.01）、藁本内酯（＜0.01）和丁烯基苯酞（＜0.05），渭源产区的是洋川芎内酯 I（＜0.01）、洋川芎内酯 H（＜0.01）、洋川芎内酯 A（＜0.01）、藁本内酯（＜0.01）；临洮产区的是绿原酸（＜0.01）、阿魏酸（＜0.01）、阿魏酸松柏酯（＜0.01）、丁烯基苯酞（＜0.05）；通渭产区的是阿魏酸（＜0.01）、洋川芎内酯 H（＜0.05）、洋川芎内酯 A（＜0.05）、藁本内酯（＜0.01）。建立的HPLC指纹图谱结合含量测定、CA、因子分析、PCA、OPLS-DA分析可以客观、全面、有效地确定不同产地不同品种当归中主要有效成分的差异，可为当归品种鉴别及质量控制提供有力支撑。

当归；品种差异；绿原酸；阿魏酸；洋川芎内酯 I；洋川芎内酯 H；洋川芎内酯 A；阿魏酸松柏酯；藁本内酯；丁烯基苯酞；HPLC指纹图谱；化学模式识别

当归(Oliv.) Diels为“妇科圣药”，具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效[1]，主要含有苯酞类、单萜和倍半萜类、芳香类化合物、脂肪烃及其衍生物、多糖、有机酸及其他类化学成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、增强心脑血管、糖尿病防治、保肝及其他作用[2-6]。甘肃省为当归的道地产区，种植历史悠久。目前，甘肃省已选育出6个当归品种，为“岷归1号”～“岷归6号”，其中“岷归1号”叶深绿色、叶柄和茎淡紫色，“岷归2号”叶柄、叶脉和茎均为绿色[7]。

当归是典型的生境主导型药材，其品质受产区生态环境影响显著[8]，在甘肃定西市，品种来源相同的当归因栽培环境不同，药材品质也存在差别[9]。但品种差异对药材的质量影响研究还不够深入。王明伟等[10]以漳县地区不同栽培品种（品系）当归、引种朝鲜当归及不同产地的当归药材为研究对象，测定其浸出物、挥发油、阿魏酸、丁烯基苯酞、藁本内酯、欧当归内酯 A、多糖、总黄酮含量，借助TOPSIS法，建立构建评价当归药材质量的熵权TOPSIS模型；荔淑楠等[11]采用UPLC-Q-TOF-MS技术对同一产地、同期采收的5个当归品种进行了代谢组学分析。而中药指纹图谱中潜藏着大量反映中药内在化学物质信息的数据和变量，对其挖掘和评价尤为关键[12]。近年来，有文献对当归饮片[13]、标准汤剂[14]、不同药用部位[15]、不同炮制品[16]、不同产区[17]等进行指纹图谱研究并结合含量测定评价样品质量，但对不同产地不同品种当归的质量特征研究未见报道。本研究以茎叶色差异最大的“岷归2号”与目前种植面积最大的“岷归1号”为研究对象，收集了4个产区且尽可能消除了生态环境影响的当归样本，建立了不同品种当归药材的指纹图谱，定量分析了多个成分，从化学成分角度阐明不同产地不同品种当归药材的质量特征，为不同产地不同品种当归药材质量标准的建立提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

样品来源于甘肃省4个产区的“岷归1号”（M1）和“岷归2号”（M2），每个产区的2个品种当归生境类似，栽培方式、生长年限相同。采用五点取样法在各样地采收当归样品，每产区每品种均随机选取100株，每10株为一个批次，共计80批次。采集后的样品贮存方式相同。经甘肃中医药大学中药资源教研室晋玲教授鉴定为伞形科植物当归(Oliv.) Diels的干燥根（表1）。

1.2 试剂

对照品绿原酸（批号A22GB158496）、阿魏酸（批号G13S11L124423）、洋川芎内酯 I（批号G27A11L122339）、洋川芎内酯 H（批号S25GB162334）、洋川芎内酯 A（批号A05GB157054）、阿魏酸松柏酯（批号J29GB156316）、藁本内酯（批号A26GB158725）、丁烯基苯酞（批号Y21J10W88899）均购至上海源叶生物科技有限公司，质量分数均不低于98%；冰醋酸（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号20180917）；甲醇（色谱纯，默克股份两合公司，批号I1147507117）；屈臣氏饮用水。

1.3 仪器

PL-S60型超声波清洗仪（康士洁）；EX224ZH 型电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；KC-08 型粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）；LC-2040C 3D高效液相色谱仪（DAD检测器）（日本岛津公司）；Shim-pack GIST-C18（50 mm×2.1 mm，2 μm）色谱柱（日本岛津公司）。

表1 80批次当归药材样品的基本信息

Table 1 Detailed information of 80 batches of A. sinensis samples

编号产区品种名生长年限/年采收时间采样点海拔/m纬度（N）经度（E） M-M1-1～M-M1-10甘肃省定西市岷县（M）岷归1号（M1）22020-10269134°29'31''104°11'17'' M-M2-11～M-M2-20甘肃省定西市岷县（M）岷归2号（M2）22020-10269134°29'31''104°11'17'' W-M1-1～W-M1-10甘肃省定西市渭源县（W）岷归1号（M1）22020-10250735°2'39''104°1'5'' W-M2-11～W-M2-20甘肃省定西市渭源县（W）岷归2号（M2）22020-10250735°2'39''104°1'5'' L-M1-1～L-M1-10甘肃省定西市临洮县（L）岷归1号（M1）22021-10255235°37'2''104°7'34'' L-M2-11～L-M2-20甘肃省定西市临洮县（L）岷归2号（M2）22021-10255235°37'2''104°7'34'' T-M1-1～T-M1-10甘肃省定西市通渭县（T）岷归1号（M1）22021-10197035°24'2"105°1'21" T-M2-11～T-M2-20甘肃省定西市通渭县（T）岷归2号（M2）22021-10197035°24'2"105°1'21"

2 方法

2.1 混合对照品溶液的制备

取对照品绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、洋川芎内酯 A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞适量，精密称定，加入甲醇配制成质量浓度分别为0.54、0.56、0.30、0.23、0.84、0.25、1.14、1.05 mg/mL的混合对照品溶液，保存于冰箱备用。

2.2 供试品溶液的制备

称取当归样品粉末4.0 g，置于50 mL棕色量瓶中，加入40 mL甲醇，称定质量；量瓶置于烧杯中，超声45 min，取出后放凉至室温，再次称定质量，用甲醇补足失重，摇匀滤过，取续滤液进高效液相进行分析。

2.3 色谱条件

色谱条件参考徐小琼等[8]的研究，经预实验后，得出本实验的最佳色谱条件。色谱柱为Shim-pack GIST-C18（50 mm×2.1 mm，2 μm）流动相为1%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），体积流量0.1 mL/min；梯度洗脱，0～3 min，5%～18% B；3～4.5 min，18%～35% B；4.5～7 min，35%～55% B；7～13 min，55%～70% B；13～18 min，70%～80% B；18～23 min，80% B，23～25 min，80%～100% B；25～28 min，100%～5%B；28～35 min，5%B；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量5 µL。

2.4 “岷归1号”与“岷归2号”样品HPLC指纹图谱研究

2.4.1 精密度试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，按“2.3”项分析，连续进样6次，分别计算各共有峰的保留时间与峰面积。结果表明各共有峰保留时间的RSD＜0.31%，各共有峰峰面积的RSD＜1.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，平行6份，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，按“2.3”项分析，分别计算各共有峰的保留时间与峰面积，结果表明各共有峰的保留时间的RSD＜1.0%，各共有峰的峰面积的RSD＜2%。表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h进样，按“2.3”项分析，计算各共有峰的保留时间及峰面积。结果各共有峰的保留时间的RSD＜0.30%，各共有峰的峰面积的RSD＜2.0%。表明供试品在24 h内稳定。

2.4.4 指纹图谱的建立及化学计量学分析 分别称取80批当归样品粉末各4.0 g，按“2.2”项下条件制备成当归供试品溶液，按“2.3”项分析。将所得的样品数据全谱按产区差异分4次导入国家药典委员会组织定型的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件中，采用中位数法，时间窗口设定为0.5 min，分别选取M-M1-1、W-M1-1、T-M1-1、L-M1-1作为参照图谱（R），生成当归药材中药指纹图谱，并进行相似度计算。将得到的16个共有峰的峰面积导入SPSS（25.0版本）进行聚类分析（cluster analysis，CA）、因子分析、Fisher线性判别（fisher linear discrimination analysis，FLDA），使用SIMCA 14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），进行自动拟合求解。使用Prism GraphPad 8.0作图。

2.5 指标成分含量测定

2.5.1 线性关系 将“2.1”项下配制好的混合对照品溶液，分别精密移取1、2、3 mL于10 mL棕色量瓶，定容，摇匀，同法再移取后2份稀释后的对照品溶液各3 mL再次稀释，最终配制成6份不同浓度的混合对照品溶液。按“2.3”项分析，以对照品质量浓度为横坐标（），各对照品峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（2），结果见表2，各成分在浓度范围内线性关系良好。

表2 标准曲线回归方程

Table 2 Regression equation of standard curve

对照品标准曲线R2线性范围/(µg·mL−1) 绿原酸Y＝3×107X＋31 1010.999 89.72～540.00 阿魏酸Y＝1×108X－232 6060.999 610.8～560.00 洋川芎内酯 IY＝2×108X＋1 000 000.998 95.4～300.0 洋川芎内酯 HY＝2×108X＋681 8490.999 14.14～230.00 洋川芎内酯 AY＝2×107X＋134 6330.998 615.12～840.00 阿魏酸松柏酯Y＝2×108X－175 9651.000 04.5～250.0 藁本内酯Y＝5×107X＋298 7801.000 020.52～1 140.00 丁烯基苯酞Y＝8×107X＋1 000 000.999 718.90～1 050.00

2.5.2 精密度试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，按“2.3”项分析，连续进样6次，分别计算各共有峰的保留时间与峰面积。结果表明绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、洋川芎内酯 A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞RSD依次为1.1%、0.54%、1.0%、0.35%、1.5%、0.88%、0.83%、0.47%。表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，平行6份，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，按“2.3”项分析，分别计算各共有峰的保留时间与峰面积，结果表明各共有峰的保留时间的RSD＜1.0%，各共有峰的峰面积的RSD＜1.2%。表明本方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，按“2.3”项分析，计算各共有峰的保留时间及峰面积。结果各共有峰的保留时间的RSD＜1.8%，各共有峰的峰面积的RSD＜2.0%。表明供试品在24 h内稳定。

2.5.5 加样回收率试验 称取编号为M-M2-12的当归样品粉末4.0 g，共计6份，以近1∶1的比例加入相应化学成分的对照品，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，按“2.3”项分析，分别记录各共有峰的保留时间与峰面积，计算各成分的加标回收率和RSD值。绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、洋川芎内酯 A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞的平均加样回收率分别为99.1%、100.9%、102.2%、95.4%、99.2%、102.4%、100.1%、98.4%；RSD值分别为1.5%、1.5%、2.8%、1.8%、2.3%、3.0%、1.7%、1.8%。

2.5.6 样品测定 按“2.2”项下条件制备供试品溶液，每个样品平行制备2份，按“2.3”项分析，记录峰面积，按标准曲线计算各待测成分的含量。

3 结果与分析

3.1 HPLC指纹图谱的建立

将80批次样品色谱数据按样品产区差异分4批导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立80批样品的HPLC指纹图谱（图1），分别选取M-M1-1、W-M1-1、T-M1-1、L-M1-1作为参照图谱（R），时间窗口设定为0.5 min，以中位数法建立对照图谱，共得到稳定性较好的16个色谱峰作为共有峰（图2，以M-M1-1为例）。取当归样品溶液，按“2.3”项分析，通过与混合对照品溶液色谱图比对、查阅文献资料共指认出8个色谱峰，其中2号峰为绿原酸，3号峰为阿魏酸，5号峰为洋川芎内酯 I，6号峰为洋川芎内酯 H，9号峰为洋川芎内酯 A，10号峰为阿魏酸松柏酯，12号峰为藁本内酯，13号峰为丁烯基苯酞。

3.2 相似度评价

采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件（2012版）》对80批次的当归药材色谱数据进行分析，生成指纹图谱，并计算得到相似度评价结果见表3。结果表明，4个产区当归品种内和品种间相似度均值均在0.9以上，其中渭源产区“岷归2号”种内的相似度均值（0.979）略低于当归品种间相似度均值（0.983），其他品种内相似度均值均高于相应的品种间相似度均值，品种间相似度均值最高的是渭源产区（0.983），最低的是临洮产区（0.960）。

图1 80批次当归HPLC指纹图谱

2-绿原酸 3-阿魏酸 5-洋川芎内酯I 6-洋川芎内酯H 9-洋川芎内酯A 10-阿魏酸松柏酯 12-藁本内酯 13-丁烯基苯酞

表3 相似度评价结果

Table 3 Similarity evaluation results

产区 M1品种内相似度M1品种内相似度平均值M2品种内相似度M2品种内相似度平均值品种间相似度品种间相似度平均值 岷县0.969～0.9990.9910.982～1.0000.9950.903～0.9960.962 渭源0.992～0.9990.9960.939～0.9970.9790.945～0.9960.983 临洮0.985～0.9990.9950.953～1.0000.9900.939～0.9820.960 通渭0.948～1.0000.9860.948～1.0000.9900.927～0.9970.975

3.3 “岷归1号”与“岷归2号”的化学模式识别

3.3.1 CA 使用SPSS 25.0版软件，以4个产区的80批当归指纹图谱的16个共有峰峰面积为变量，采用组间平均连接法，以欧氏距离平方作为样品的测度，对80批药材采用系统聚类分析法进行模式识别分析，探讨4个产区2个品种之间样品成分含量的一致性，结果见图3。岷县产区的CA距离图显示，当距离刻度为25时，20批当归样品基本按品种分为2类，其中岷县“岷归1号”的3、4号样品与“岷归2号”的10批样品聚为一类，剩余的8批“岷归1号”样品聚为一类。渭源产区的CA距离图显示，当距离刻度为25时，20批当归样品同样基本按品种分为2类，其中“岷归2号”的13、17和20号样品与“岷归1号”的10批样品聚为一类，剩余的7批“岷归2号”样品聚为一类。临洮产区的CA距离图显示，当距离刻度为25时，20批当归样品完全按品种分为2类。通渭产区的CA距离图显示，当距离刻度为25时，20批当归样品同样基本按品种分为2类，其中“岷归1号”的1、2号样品与“岷归2号”的10批样品聚为一类，剩余的8批“岷归1号”样品聚为一类。

3.3.2 PCA 采用多元统计分析软件SIMCA 14.1对16个共有峰进行PCA分析，得分矩阵图（岷县2为0.823，预测能力（2）为0.649；渭源2为0.977，2为0.684；临洮2为0.993，2为0.851；通渭2为0.993，2为0.857；）见图4。整体上看，聚类并不明显，但可以看出聚类趋势是80批样品按品种沿轴（渭源、临洮、通渭）或轴（岷县）聚为2类。

图3 不同品种当归聚类分析树状图

图4 80批次当归PCA分析

3.3.3 因子分析 通过SPSS 25.0版软件进行因子分析，使用主成分分析法，岷县提取了2个特征值大于1的主成分，渭源、临洮各提取了3个特征值大于1的主成分，通渭提取了4个特征值大于1的主成分。由当归药材指纹图谱共有峰特征值和累积方差贡献率表（表4）可知，4个产区特征值大于1的主成分的累积方差贡献率分别达到82.334%、82.408%、91.818%、89.497%，说明这些主成分是反映2个当归品种差异的关键因素。

表4 特征值和累积方差贡献率

Table 4 Eigenvalues and cumulative variance contribution rates

产区主成分因子特征值方差贡献率/%累积方差贡献率/% 岷县17.38346.14446.144 25.79036.19182.334 渭源18.62153.88453.884 23.00418.77572.659 31.560 9.74982.408 临洮18.83755.23255.232 24.44427.77483.006 31.410 8.81291.818 通渭17.14744.66944.669 24.05125.32269.991 32.11813.24083.231 41.003 6.26689.497

采用最大方差法得到旋转后的成分矩阵，由矩阵（表5）可知各个共有峰对特征值大于1的主成分的贡献率，岷县地区第1主成分主要代表了峰2、峰4～7、峰13；第2主成分主要代表了峰10～12、峰14～16。渭源地区第1主成分主要代表了峰3、峰8、峰10、峰14～15；第2主成分主要代表了峰1、峰5、峰6、峰9、峰11；第3主成分的信息主要来自峰2、峰7、峰13。临洮地区第1主成分主要代表了峰4～6、峰9～10、峰13～16；第2主成分主要代表了峰1、峰3、峰7～8；第3主成分的信息主要来自峰12。通渭地区第1主成分主要代表了峰4～5、峰7～8、峰10、峰13～14；第2主成分主要代表了峰3、峰11～12、峰15～16；第3主成分主要代表了峰1；第4主成分的信息主要来自峰9。

3.3.4 OPLS-DA 以80批当归样品共有峰峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA分析，得分矩阵图见图5。各产区所建模型对和矩阵的解释率（2和2）及模型的2见表6，各模型的2、2及2值均大于0.5；置换检验200次，结果如图6。4个模型均稳定可靠，可用于2个品种当归样品的分析。

由OPLS-DA得分图（图5）可知，2个品种当归可明显区分，与PCA结果一致，且组别间分离效果更加显著，进一步通过计算各个共有峰的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（图7），以VIP值大于1为标准，筛选可以作为品种间相互区分的差异性指标，结果显示岷县地区依次为峰12、11、1、5、6、15、4、2；渭源地区依次为峰1、9、11、16、5、6、12、4；临洮地区依次为峰11、2、1、3、13；通渭地区依次为峰11、12、15、16、6、5、3。

表5 旋转后的成分矩阵

Table 5 Loading factor of principal components

峰号载荷（岷县）峰号载荷（渭源）峰号载荷（临洮）峰号载荷（通渭） 121231231234 20.9470.051150.8430.2800.290150.9470.2820.064 40.8870.0730.2650.337 40.942−0.004140.8420.3360.305140.9030.3150.130 70.8810.220.3250.139 60.931−0.264 80.804−0.0450.301160.8830.3550.183140.8690.297−0.2430.168 50.925−0.259100.7920.2130.075 90.8620.420−0.219 50.866−0.2990.2570.242 70.9150.195 30.7780.2030.184 60.8280.171−0.508100.8480.087−0.3450.062 130.8180.203160.6810.6300.225100.786−0.582−0.055130.830−0.22−0.3900.129 10.582−0.564 10.0270.9690.095 50.7790.172−0.554 80.7780.0610.3380.299 140.0670.966 9−0.066−0.8500.368 40.7780.436−0.40511−0.0350.9240.113−0.250 15−0.2230.952 50.3010.8200.254130.777−0.357−0.40412−0.4590.830−0.204−0.039 160.2110.910 60.3690.7630.254 10.0960.9590.203150.4910.828−0.1900.083 10−0.1640.848110.6380.7030.020 30.0760.8960.130 3−0.0500.8160.283−0.058 12−0.6530.714120.6250.626−0.168 80.4920.803−0.081160.5560.766−0.0530.180 11−0.6780.700 70.1390.0750.925 70.5890.747−0.241 10.0010.0760.9760.058 80.5440.679 20.1140.0420.874 20.3900.6960.551 90.192−0.1390.0530.865 30.5610.624130.443−0.0530.79512−0.2220.0930.774 60.457−0.2390.5150.630 90.4610.464 40.3960.5280.574110.1130.6280.699 20.3730.482−0.1730.554

2-绿原酸 3-阿魏酸 5-洋川芎内酯 I 6-洋川芎内酯 H 9-洋川芎内酯 A 10-阿魏酸松柏酯 12-藁本内酯 13-丁烯基苯酞

2-chlorogenic acid 3-ferulic acid 5-senkyunolide I 6-senkyunolide H 9-senkyunolide A 10-coniferyl ferulate 12-ligustilide 13-butenyl phthalide

图5 80批当归OPLS-DA得分图

表6 4个产区OPLS-DA模型的解释率及预测能力

Table 6 Interpretation rate and prediction ability of OPLS-DA model in four producing areas

产区R2XR2YQ2 岷县0.8760.9020.814 渭源0.8090.9470.890 临洮0.9850.9930.985 通渭0.8010.9550.712

3.4 不同产区当归的化学成分含量测定及判别分析验证

3.4.1 当归中8个指标成分含量测定 当归中含有多种有效成分，通过查阅文献[9,17]及筛选出的VIP值大于1的差异性指标确定了其中的8种成分作为鉴别“岷归1号”和“岷归2号”的指标成分，结果见表7。由表可以看出不同品种当归中所选的8个指标成分含量存在差异。通过分析含量测定结果柱形图（图8），可以明确不同当归品种中差异显著的指标成分，如《中国药典》2020年版中规定检测的阿魏酸含量在岷县和渭源地区2品种间无显著差异，而在临洮和通渭地区存在极显著和显著差异，且“岷归1号”均高于“岷归2号”。

3.4.2 FLDA 利用SPSS 25.0统计软件的Fisher线性判别分析验证所选的8个指标成分作为当归品种识别的适用性，对来自“岷归1号”和‘岷归2号”的80批样本按品种进行分组建模，以绿原酸（a）、阿魏酸（b）、洋川芎内酯 I（c）、洋川芎内酯 H（d）、洋川芎内酯 A（e）、阿魏酸松柏酯（f）、藁本内酯（g）、丁烯基苯酞（h）作为判别变量，4个产区分别各自建立1个判别函数（discriminant function，DF），且各判别函数的Lambda检验显著性均小于0.05（表8）。

由样本自身验证及交叉验证结果，自身验证判别中只有渭源产区中“岷归2号”一个样本被误判为“岷归1号”，样本总正确判别率达95%，其他3产区样本总正确判别率均为100%；样本交叉验证结果中岷县产区中“岷归1号”中2个样本被误判为“岷归2号”，样本总正确判别率达90%；渭源产区中“岷归1号”中2个样本被误判为“岷归2号”，“岷归2号”中3个样本被误判为“岷归1号”，样本总正确判别率达75%；临洮地区样本总正确判别率为100%；通渭产区中“岷归1号”中1个样本被误判为“岷归2号”，“岷归2号”中1个样本被误判为“岷归1号”，样本总正确判别率达90%。表明绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、洋川芎内酯 A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞可以作为品种区分的指标成分。

图6 OPLS-DA模型置换检验结果

2-绿原酸 3-阿魏酸 5-洋川芎内酯I 6-洋川芎内酯 H 9-洋川芎内酯A 10-阿魏酸松柏酯 12-藁本内酯 13-丁烯基苯酞 绿色表示VIP值大于1

表7 当归中指标成分测定结果(n＝2)

Table 7 Determination results of marker components in A. sinensis(n＝2)

编号质量分数/(mg·g−1) 编号质量分数/(mg·g−1) ABCDEFGHABCDEFGH M-M1-10.049 00.021 00.077 00.007 50.017 40.011 90.254 10.026 0L-M1-10.073 00.015 30.014 10.000 90.017 20.076 40.590 20.022 7 M-M1-20.052 40.022 10.086 20.008 10.019 90.013 40.250 60.027 6L-M1-20.082 20.017 40.018 20.001 80.021 70.083 20.618 00.024 2 M-M1-30.045 10.017 90.056 10.006 10.017 10.009 00.219 10.026 1L-M1-30.088 00.018 40.021 50.002 20.024 10.090 60.621 70.030 8 M-M1-40.041 20.017 60.059 20.006 50.012 90.007 90.243 80.022 1L-M1-40.092 30.023 40.027 00.003 10.027 40.082 40.639 20.026 5 M-M1-50.053 10.020 30.085 80.008 10.026 20.011 20.247 70.027 8L-M1-50.087 10.024 70.029 00.003 30.026 40.063 60.618 50.024 3 M-M1-60.051 80.018 20.088 10.008 10.022 00.007 10.222 10.027 0L-M1-60.079 80.024 10.025 90.002 80.022 90.058 30.594 90.026 1 M-M1-70.050 30.018 40.084 40.008 10.016 40.007 20.204 70.023 0L-M1-70.078 40.021 00.020 70.002 20.021 90.076 00.602 20.027 2 M-M1-80.059 10.020 30.092 80.009 00.023 50.010 20.238 00.026 7L-M1-80.075 70.020 60.020 10.002 10.022 20.084 90.616 40.028 5 M-M1-90.053 40.018 70.086 40.008 10.020 60.006 50.219 30.026 3L-M1-90.079 00.020 90.020 10.002 20.022 00.090 40.607 50.035 8 M-M1-100.049 10.020 10.078 80.007 30.017 50.008 10.235 30.024 0L-M1-100.085 90.021 90.020 80.002 40.021 90.088 20.611 60.034 7 M-M2-110.045 50.019 70.044 10.005 10.019 00.010 60.289 50.024 1L-M2-110.054 30.014 80.024 50.002 70.020 90.098 90.608 20.038 8 M-M2-120.048 70.020 10.058 80.006 40.016 10.011 40.276 50.024 2L-M2-120.063 60.015 50.036 50.004 90.027 00.103 60.587 70.059 4 M-M2-130.049 00.019 10.055 30.006 10.021 70.009 00.253 00.023 7L-M2-130.067 50.017 20.040 70.005 70.027 70.101 10.571 40.061 2 M-M2-140.048 00.019 60.061 40.006 40.023 80.009 90.273 30.026 6L-M2-140.066 30.018 50.031 20.003 90.026 20.099 00.611 10.046 3 M-M2-150.042 30.018 70.049 00.005 40.019 40.010 60.284 50.021 5L-M2-150.065 40.020 30.025 60.002 90.023 90.095 60.619 30.039 5 M-M2-160.043 60.018 20.053 30.005 90.019 60.009 00.285 60.023 8L-M2-160.046 00.015 40.016 90.001 40.015 50.084 20.585 40.029 4 M-M2-170.046 50.019 10.049 50.005 60.021 20.011 10.299 00.025 7L-M2-170.045 20.016 30.014 20.000 80.014 10.080 90.596 90.026 4 M-M2-180.041 10.017 80.038 70.004 50.016 20.012 10.298 30.021 6L-M2-180.045 10.016 40.013 90.000 50.012 50.072 90.578 30.021 7 M-M2-190.041 80.019 50.040 10.004 50.021 50.013 90.309 10.024 5L-M2-190.057 90.018 30.041 90.006 40.033 20.101 40.445 20.048 8 M-M2-200.045 70.019 10.049 80.005 70.022 30.009 90.290 40.023 1L-M2-200.038 10.017 50.018 20.001 20.015 10.075 60.596 80.032 4 W-M1-10.042 20.017 40.053 20.005 70.008 10.006 30.181 70.022 8T-M1-10.050 50.017 30.016 40.000 30.014 00.072 40.563 00.029 5 W-M1-20.040 10.015 40.049 80.005 30.011 90.003 70.168 10.020 3T-M1-20.054 20.018 30.040 80.003 20.025 40.096 90.451 00.045 8 W-M1-30.037 60.018 30.050 60.005 50.006 30.005 90.210 10.019 8T-M1-30.037 00.023 00.025 40.001 70.014 60.082 90.570 50.027 3 W-M1-40.050 30.019 30.060 80.006 00.007 90.006 30.184 70.023 3T-M1-40.039 50.023 80.024 20.001 10.013 10.079 60.574 70.025 6 W-M1-50.041 60.015 40.050 60.005 40.009 60.005 20.173 00.022 7T-M1-50.044 40.021 60.025 90.001 40.020 50.088 50.567 00.030 0 W-M1-60.043 90.016 50.056 70.005 70.009 00.004 30.204 90.023 5T-M1-60.034 80.019 80.019 50.000 60.013 00.081 00.564 30.025 5 W-M1-70.049 70.017 40.055 40.005 80.008 50.005 00.200 60.024 0T-M1-70.032 50.020 30.019 20.000 60.012 30.076 90.559 40.024 9 W-M1-80.047 40.016 80.053 20.005 60.007 30.005 50.197 50.021 8T-M1-80.044 80.019 70.025 90.001 60.034 00.089 10.539 80.032 0 W-M1-90.043 00.015 20.047 60.005 00.007 50.003 60.177 60.021 0T-M1-90.043 60.020 30.026 00.002 60.036 20.087 60.576 70.027 9 W-M1-100.044 30.016 00.058 20.005 90.008 00.004 10.192 40.023 8T-M1-100.051 60.020 20.029 70.002 80.040 10.091 20.554 10.032 2 W-M2-110.045 10.016 50.043 00.004 70.014 20.004 70.154 60.022 0T-M2-110.017 40.019 00.022 70.002 20.031 20.046 30.516 40.019 0 W-M2-120.045 70.016 30.042 40.004 70.014 60.004 80.148 10.022 5T-M2-120.030 20.016 70.027 80.001 50.028 90.095 20.494 80.039 3 W-M2-130.043 50.017 30.048 70.005 30.014 60.005 90.216 30.024 2T-M2-130.035 90.021 20.030 00.001 80.030 30.096 80.511 60.039 3 W-M2-140.036 60.015 80.043 00.004 70.011 80.003 60.141 50.019 1T-M2-140.036 90.021 30.030 20.001 90.024 90.093 60.498 70.037 3 W-M2-150.044 30.014 70.040 90.004 30.013 00.004 30.125 20.021 2T-M2-150.020 10.015 50.031 30.001 90.019 50.090 50.467 60.031 9 W-M2-160.045 00.016 30.045 60.005 00.018 40.004 50.130 50.025 2T-M2-160.047 50.020 10.033 10.004 20.030 40.094 60.530 60.034 6 W-M2-170.042 00.017 10.054 50.005 90.010 30.003 50.185 10.022 2T-M2-170.021 60.015 60.030 90.001 90.019 20.089 40.469 00.031 8 W-M2-180.047 40.017 50.053 90.005 80.017 90.004 20.128 30.023 0T-M2-180.047 20.019 10.033 10.004 10.029 60.094 80.519 40.034 7 W-M2-190.045 10.015 40.041 20.004 70.017 90.003 30.099 60.021 3T-M2-190.044 00.018 20.029 80.003 90.029 00.082 80.454 00.028 7 W-M2-200.047 40.017 80.046 30.005 10.019 30.004 60.184 40.024 9T-M2-200.043 50.018 00.030 30.003 90.028 70.081 50.450 10.029 8

A-绿原酸 B-阿魏酸 C-洋川芎内酯I D-洋川芎内酯 H E-洋川芎内酯 A F-阿魏酸松柏酯 G-藁本内酯 H-丁烯基苯酞

A-chlorogenic acid B-ferulic acid C-senkyunolide I D-senkyunolide H E-senkyunolide A F-coniferyl ferulate G-ligustilide H-butenyl phthalide

A-绿原酸 B-阿魏酸 C-洋川芎内酯I D-洋川芎内酯H E-洋川芎内酯A F-阿魏酸松柏酯 G-藁本内酯 H-丁烯基苯酞 *P＜0.05 **P＜0.01

表8 4个产区不同品种当归的判别函数

Table 8 Discriminant functions of different varieties of A. sinensis from four producing areas

产区判别函数组质心处的函数Lambda检验 M1M2 岷县DF=−19.16＋326.72 a+319.85 b−178.08 c＋260.48 d＋141.47 e−484.65 f＋64.43 g−303.14 h−3.0873.087P＜0.05 渭源DF=4.05＋111.39 a−1141.78 b＋87.74 c＋1766.47 d−215.11 e＋868.91 f＋9.95 g−310.55 h1.919−1.919P＜0.05 临洮DF=−16.9−233.6 a＋200.47 b＋1 161.89 c−2 372.16 d−715.58 e＋268.19 f＋14.43 g−236.56 h−4.9554.955P＜0.05 通渭DF=14.78−297.369 a＋256.02 b−770.37 c＋3 755.04 d−29.05 e＋22.75f−24.23 g＋522.46 h−2.7902.790P＜0.05

4 讨论

4.1 指纹图谱及模式识别分析

本实验对于多批次当归药材指纹图谱的评价不仅仅局限于相似度评价，还采用了CA、因子分析、PCA、OPLS-DA分析，最后还利用Fisher线性判别分析验证所选的8个指标成分作为当归品种识别的适用性，更加全面客观地评价药材质量。

各产区2个品种内部和品种间的相似度均大于0.9，说明当归药材的整体质量是相对稳定的，但是品种间相似度值普遍低于品种内部，这说明2品种之间还是存在差异；CA聚类图也表明2品种存在差异，在距离刻度为25时，4个产区的当归基本按品种分为了2类，这就说明了2品种是存在差异的，但也有少量样品未按品种聚类，这说明当归药材的整体质量是稳定的；PCA得分图也反映了这种现象，在得分图中聚类不是特别明显，但可以看出趋势是按品种聚类。

根据因子分析和OPLS-DA分析中特征值或VIP值大于1筛选出“岷归1号”与“岷归2号”成分差异的主要影响因子。因子分子中采用最大方差法得到旋转后的成分矩阵，所选16个共有峰的荷载值均较高；在OPLS-DA分析中VIP值大于1的成分有峰1、峰2（绿原酸）、峰3（阿魏酸）、峰4、峰5（洋川芎内酯I）、峰6（洋川芎内酯H）、峰9（洋川芎内酯A）、峰11、峰12（藁本内酯）、峰13（丁烯基苯酞）、峰15、峰16。说明所选的8个有效成分均可以作为当归品种差异的指标成分。

4.2 多成分含量测定

目前甘肃省的主要栽培品种为“岷归1号”，而“岷归2号”近年来逐步开始推广种植，随着“岷归2号”种植面积不断增加，不同品种当归对市场中流通的当归药材品质的影响将会逐步增加。所以，明确“岷归1号”与“岷归2号”的有效成分含量差异对当归质量评价、品种鉴别及指导临床用药具有非常重要的作用。

本实验收集了4个产区的共80批的“岷归1号”与“岷归2号”的当归样品，所选样品的生长环境、栽培方式和存贮方式一致，尽量消除环境对测定结果的影响。测定结果经正态分布检验和方差齐性检验，选择适合的差异检验方法，对符合方差分析条件的数据进行了方差分析，剩余的数据采用独立样本Mann-Whitney U检验。2个当归品种在4个产区中有4～5种成分的差异，各产区差异的成分不尽相同，通过Fisher线性判别分析，构建了各产区的当归品种判别函数，由样本自身验证及交叉验证结果，除渭源产区的样本交叉验证正确判别率略低（75%）外，其他验证的正确判别率均不低于90%，说明所选的8种有效成分非常适合作为当归品种鉴别的指标成分，也可以为当归品种鉴别提供一些参考。

一个值得注意的问题是，在本实验的检测结果中，岷县和渭源产区当归的藁本内酯和阿魏酸松柏酯的含量较低，而在临洮和通渭产区的含量较高，其他学者的研究中也显示藁本内酯和阿魏酸松柏酯应该是在此8种有效成分含量较高的2种成分[8, 16-17]，推测主要原因是岷县渭源2产区的样品比临洮通渭2产区的样品存贮时间多了一年，而阿魏酸松柏酯性质很不稳定，在甲醇、强酸性、强碱性、光照及高温等环境下易转化为阿魏酸与松柏醇[18]，藁本内酯具有不稳定的苯酞结构，易发生氧化、脱氢、水解等或异构化为其他结构相似的苯酞类化合物。房鑫等[19]报道藁本内酯室温放置1个月后采用色谱法测定转化物，基本全部转化为14个组分，其中主要包括7′-羧基-芎萘呋内酯、欧当归内酯 A、洋川芎内酯 I、Z-丁烯基苯酞和洋川芎内酯 A等。本实验中岷县渭源产区中较高的洋川芎内酯 I和洋川芎内酯A也符合推测。

本研究通过HPLC建立了2个品种当归的指纹图谱并同时测定其中8种成分的含量，结合多种模式识别分析，对“岷归1号”与“岷归2号”的质量差异做出了较为全面的分析，但还是存在很多不足之处：一是岷县渭源产区的样品与临洮通渭样品的存储时间不一致，如能保持一致，就能消除藁本内酯和阿魏酸松柏酯转化带来的影响；二是判别函数的验证，虽然经过了样本自身验证及交叉验证，但还需要收集更多的样本进行验证；三是所选的指标成分不够全面，本实验中选定的8种有效成分属于有机酸类和苯酞类成分，而当归中还有一类的重要的活性成分是多糖类[20-21]，后期课题组会不断完善，为当归质量评价提供更加全面的理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality differences of different origins and varieties ofbased on HPLC multi-index composition determination and multi-pattern recognition method of fingerprint

ZHANG Ming-hui1, ZHU Tian-tian1, 2, 3, JIN Ling1, 2, 3, WANG Fu-sheng4, XU Li1, KANG Shu-qi1

1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou730000, China 2. Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine Co-constructed by Gansu Province & MOE of PRC, Lanzhou 730000, China 3. Engineering Research Center for Evaluation, Protection, and Utilization of Rare Traditional Chinese Medicine Resources, Gansu Province, Lanzhou 730000, China 4. Dingxi Academy of Agricultural Sciences, Dingxi 743000, China

The HPLC fingerprint ofwas established and the content of its main effective components was determined. Combined with a variety of stoichiometric analyses, the different components of different varieties (Mingui I and Mingui II) ofwere determined to provide a reference for its quality control.HPLC method was used to establish the fingerprint of different varieties ofand determine the content of index components. The data were analyzed by similarity evaluation combined with cluster analysis (CA), factor analysis, principal component analysis (PCA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA), Fisher linear discriminant (FLDA).A total of 16 common peaks infrom different origins were calibrated by HPLC fingerprint. Eight chromatographic peaks of chlorogenic acid, ferulic acid, senkyunolide I, senkyunolide H, senkyunolide A, coniferyl ferulate, ligustilide, and butenyl phthalide were identified. The differences between the two varieties ofin the Min County were chlorogenic acid (＜0.01), senkyunolide I (＜0.01), senkyunolide H (＜0.01), ligustilide (＜0.01) ) and butenyl phthalide (＜0.01), in Weiyuan, were senkyunolide I (＜0.01), senkyunolide H (＜0.01),senkyunolide A (＜0.01), ligustolide (＜0.01); In Lintao werechlorogenic acid (＜0.01), ferulic acid (＜0.01), coniferyl ferulate (＜0.01), butenyl phthalide (＜0.05); In Tongwei were ferulic acid (＜0.01), senkyunolide H (＜0.05), senkyunolide A (＜0.05), and ligustolide (＜0.01).The established HPLC fingerprint combined with content determination, CA, factor analysis, PCA, OPLS-DA can objectively, comprehensively, and effectively determine the differences of main effective components in different varieties of, and it can provide strong support for the variety identification and quality control of.

(Oliv.) Diels; variety differences; HPLC fingerprint; chlorogenic acid; ferulic acid; senkyunolide I; senkyunolide H; senkyunolide A; coniferyl ferulate; ligustilide; butenyl phthalide; chemical pattern recognition

R286.12

A

0253 - 2670(2022)19 - 6187 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.025

2022-02-03

甘肃省科技厅创新基地和人才计划目（20JR5RA182）；道地药材生态种植及质量保障项目项目（国中医药科技 [2020] 153号）；甘肃省教育厅“双一流”科研重点项目（GSSYLXM-05）；甘肃中医药大学科学研究与创新基金项目（2021KCZD-4）；西北中藏药省部共建协同创新中心开放基金资助项目（Xbzzy202207）

张明惠（1995—），女，硕士研究生，主要从事中药资源保护、评价与可持续利用研究。Tel: 17367721554 E-mail: 2244670610@qq.com

朱田田，副教授，硕士生导师，主要从事中药资源评价与分子生药学研究。Tel: (0931)5161169 E-mail: ztt0935@163.com

[责任编辑 时圣明]