寡聚核苷酸介导的基因突变技术创制抗除草剂烟草新种质

谢宇峰， 秦利军

( 贵州大学 农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院， 贵阳 550025 )

烟草()为茄科(Solanaceae)烟草属()一年生或有限多年生草本植物，是一种经济价值较高的作物，除主要用于吸食外，烟草还具有蛋白食用及药用价值。烟草在我国南方和北方均有种植，面积达146.67万 hm，年均产量约30亿 kg，在我国占有极大的经济市场(张杰等，2018)，是国家和地方财税的重要经济来源。然而，烟田杂草危害烟草生产，严重影响烟草的产量和质量。烟田杂草不仅与烟草争夺水分、养分、光照和空间，而且作为烟草病虫害传播的中间宿主，极大影响了烟草的产量和质量(蔡海林等，2020)。在烟田中，氯磺隆、草甘膦除草剂可以通过靶向结合植物体中的乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)用以抑制缬氨酸(valine，Val)、亮氨酸(leucine，Leu)、异亮氨酸(isoleucine，Ile)的生物合成，进而导致杂草死亡(Scoloss & Ciskanik, 1988)。虽然这类除草剂在杀灭杂草时具有活性高且药量低、对哺乳动物低毒、生态环境友好的特点，但会极大影响农作物的生长和发育(Grandpmo & Peter, 1998；牛聪伟，2005)。ALS中特定氨基酸突变会使细胞系或植株产生对除草剂的抗性(Kleschick & Costales, 1990; Scoloss, 1990)，如拟南芥()中ALS氨基酸保守区域第197位氨基酸由脯氨酸(proline，Pro)突变为丝氨酸(serine，Ser)，会使细胞系具有对氯磺隆(chlorsulfuron，Chl)和苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)等磺酰脲类除草剂产生抗性；甘蓝()中ALS保守氨基酸序列(ahas3r)第557位Pro突变为谷氨酰胺(glutamine，Gln)，会使细胞系具有对三唑嘧啶(triazole pyrimidine)类除草剂抗性(Saari & Maxwell, 1997)。此外，水稻()中ALS特定氨基酸的突变会使植株产生对除草剂的抗性。将ALS氨基酸第95位甘氨酸(glycine，Gly)突变为丙氨酸(alanine，Ala)后，获得对双草醚(bispyribac-sodium)产生抗性的水稻植株(Okuzaki et al., 2007)。烟草中，通过电穿孔及微粒轰击方式将嵌合体DNA/RNA寡聚核苷酸导入原生质体，使其基因所编码的氨基酸特定位点发生突变(脯氨酸-196-谷氨酸，色氨酸-573-亮氨酸)，获得抗氯磺隆的抗性植株(Beetham et al., 1999)。因此，利用分子生物学手段实现代谢关键酶编码基因的定点突变，是创制抗除草剂作物新种质的重要手段之一。

寡聚核苷酸介导的基因突变(OMM)技术是一种新的基因诱变技术，已被成功运用于动物及酵母的基因定点突变(Yoon et al., 1996; Alexeev et al., 2000; Bartlett et al., 2000)。在植物中，该技术已成功实现对玉米()基因发生定点突变，引起AHAS蛋白中621氨基酸由Ser突变为天冬氨酸(aspartic acid，Asp)，获得对咪唑啉酮(imidazolone)类除草剂具有抗性的突变玉米植株(Zhu et al., 1999)。Okuzaki等(2007)利用OMM技术实现水稻ALS中第171位氨基酸由Pro变为Gly，第548位氨基酸由色氨酸(tryptophan，Tyr)变为Ile以及第627位氨基酸由Ser变为Ile，获得除草剂抗性水稻。与应用广泛的成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白Cas(CRISPR/Cas)技术，以及转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术(Ishino et al.,1987; Michno et al., 2020)相比，OMM技术所诱导的突变几乎都是有目的定点突变，不会向生物体内引入新的基因。Breyer等(2009)认为通过OMM技术诱导产生的生物不应当归类于转基因生物。在对转基因生物安全性争论不休的今天，OMM技术为生物品质的改良提供了一条新的途径。本研究以烟草品种‘K326’为材料，利用同源克隆法获得基因，根据基因保守区结构分析构建RNA/DNA嵌合体分子，并利用该嵌合体实现对基因的定点突变，创制对磺酰脲类除草剂具有抗性的烟草新种质。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

烟草()品种‘K326’由贵州大学农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室保存并提供。DL 2 000 DNA marker、LA Taq with GC Buffer、DNA快速纯化回收试剂盒购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；MS培养基购自Phyto Technology Laboratoies公司；新型植物DNA提取试剂盒购自TIANGEN BIOTECH公司；胶回收试剂盒、pGEM-T Easy Vector System购自Promega公司；氯磺隆购自Sigma-Aldrich公司；RNA/DNA嵌合体由TaKaRa公司合成；基因克隆引物由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 烟草品种‘K326’基因组提取及基因克隆 以烟草品种‘K326’的叶片为材料，使用TIANGEN BIOTECH公司新型植物DNA提取试剂盒提取烟草基因组DNA。根据NCBI报道的普通烟草基因(基因登录号：X07644.1和X07645.1)序列设计同源克隆引物及含588位点和1719位点突变区扩增引物，引物序列如表1所示。

表 1 烟草ALS基因的克隆及保守区扩增引物Table 1 Cloning and conserved region amplification primer sequences of tobacco ALS gene

参照TaKaRa公司LA Taq with GC Buffer试剂盒操作方法，对基因进行扩增。扩增体系(50 μL)：0.5 μL TaKaRaTaq(5 U·μL)，25.0 μL 2 × GC BufferⅡ，8.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L)，1.0 μL R-F(20 μmol·L)，1.0 μL R-R(20 μmol·L)，1.0 μL基因组DNA(100 ng)和13.5 μL ddHO。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸160 s，35个循环后72 ℃ 延伸 10 min。

1.2.2 PCR产物连接及测序 参照Promega公司胶回收试剂盒操作方法回收PCR产物，参照Promega公司pGEM-T Easy Vector System试剂盒说明将回收的PCR产物连接于pGEM-T Easy Vector。连接有PCR产物的pGEM-T Easy Vector导入大肠杆菌()DH5α感受态菌株。将工程菌送至北京诺赛公司测序。利用DNAMAN 9.0软件中“序列拼接功能”对测序结果进行拼接，将拼接结果于NCBI数据库中比对，确认保守区。

1.2.3 RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合体构建 基于烟草品种‘K326’的基因保守区的结构，参照Kochevenko和Willmitzer(2003)的方法设计RNA/DNA嵌合体序列，交由TaKaRa公司合成。嵌合链设计基本要求与靶基因的序列一样(除了突变位点外)，通过寡聚核苷酸链代换，引入靶位点碱基序列变化。

1.2.4 基因枪介导的RNA/DNA导入烟草的愈伤组织 参照谭颖等(2013)的方法略有改动，对烟草品种‘K326’的愈伤组织进行诱导。烟草叶片经75%的酒精灭菌30 s，0.1%HgCl消毒8 min，无菌水清洗3～5次后切块(0.5 cm×0.5 cm)接种于愈伤诱导培养皿上，经过2周诱导培养后，转接于新鲜继代培养基上继续培养至出现分化芽点，分化芽接种生根培养基上生根培养。愈伤诱导培养基：MS+1.5 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；继代培养基：MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA。将烟草愈伤组织继代培养基分组，分别加入不同浓度的氯磺隆，对愈伤组织进行氯磺隆敏感性实验。氯磺隆浓度梯度分别设置为90、100、110、120、130、140、150、160 nmol·L。每个皿接种相同数量、生长状态近似的愈伤组织进行继代培养，培养条件为光照强度为2 000 lx，每日光照16 h，培养温度为(26 ± 1)℃。培养1 周后观察愈伤组织生长情况。抗性芽生根培养基：1/2MS + 0.1 mg·LNAA。愈伤诱导培养基和继代培养基中补加30 g·L蔗糖和8 g·L琼脂，生根培养基中补加30 g·L蔗糖和6 g·L琼脂，各培养基pH均为5.8。

基因枪微弹的制备参照Bio-Rad PDS-1000He使用说明书，根据程义琳等(2013)的方法，略有改动。设计基因枪轰击实验流程：称取8 mg金粉置于1.5 mL EP管中；加入1 mL无水乙醇，漩涡震荡3～5 min，10 000 r·min离心1 min，弃上清液(重复3次)；加入1 mL无菌水，震荡1 min；加入133 μL无菌水，储存在-20 ℃待用；加入13.3 μL嵌合体震荡2～3 s；加入133 μL 2.5 mol·LCaCl震荡2～3 s；加入53.3 μL 0.1 mol·Lspermidine，震荡2～3 s；在冰上静置10 min，10 000 r·min离心10～20 s，弃上清液；加入500 μL无水乙醇，冲洗2次，离心10 s，弃上清液；加入160 μL无水乙醇，均匀后，4 ℃备用(每次使用10 μL)。

基因枪介导的RNA/DNA导入烟草愈伤组织，参照Kochevenko和Willmitzer(2003)、程义琳等(2013)的方法，略有改动。具体操作：打开超净台，用70%乙醇擦拭超净台内部与基因枪的表面及基因枪内部；打开紫外灯，灭菌30 min，灭菌后吹风20 min；易裂片、微弹载体及阻拦网置于70%乙醇10 min，放在无菌滤纸上自然晾干；打开氦气瓶，将压力调制1 100 psi；将易裂片、微弹载体及阻拦网安装并固定在基因枪真空室，将带有烟草愈伤组织的培养皿放在托盘上，调节轰击距离为9 cm，关闭基因枪门，打开电源及真空泵；按下真空键“VAC”，当真空表读数为25 inHg时，按维持键“Hold”；按下“Fire”键，轰击结束，按下“通气键”至真空表读数为零。打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子用封口膜封好，转入组培室，暗恢复2 d后，氯磺隆筛选培养，温度为(26 ± 1)℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为 16 h。共做12批次，每批次接种25皿，每皿接种30～40个愈伤组织(d=0.5 cm)，共计9 500～10 000个愈伤组织块。

1.2.5 抗性分化植株ALS酶活的检测 参照陈以峰等(1998)的提取方法，取移栽后3周的野生型烟草品种‘K326’叶片1 g，加入提取介质(磷酸缓冲液A)1 mL，匀浆，2 500 r·min离心20 min，取上清液即为粗酶液；取0.5 mL反应介质(磷酸缓冲液B)，加入不同浓度的氯磺隆，这里设氯磺隆浓度梯度为0～500 nmol·L；加入30 μL粗酶液，总体积0.9 mL，蒸馏水补齐，37 ℃温育1 h，加入50 μL 3 mol·L的HSO中止反应；依次加入0.5 mL 0.83%甲萘酚和0.5 mL肌酸，60 ℃温育15 min，将溶液于2 000 r·min离心10 min，取上清液于分光光度计530 nm比色。ALS活性直接用A530 nm值来表示。以野生型烟草品种‘K326’为对照，测定抗性植株的ALS酶活。

1.2.6 抗性分化植株突变位点验证 根据烟草品种‘K326’的基因突变位点，选择跨该区段的引物进行扩增，扩增后进行测序，分析拟突变位点的变化情况，PCR产物扩增、连接及测序参照1.2.2。

2 结果与分析

2.1 烟草品种‘K326’的ALS基因克隆

以烟草品种‘K326’基因为模板，利用引物对SuRA F/SuRA R和SuRB F/SuRB R进行PCR扩增，均扩增得到一条长度约为2 000 bp的条带，且扩增条带清晰明亮。将该PCR产物分别胶回收后以pGEM-T Easy Vector进行连接，连接后的质粒载体导入大肠杆菌DH5α感受态菌株筛选阳性菌落，阳性菌落送至北京诺赛公司进行测序。测序拼接结果表明，以SuRA F/SuRA R引物扩增到序列长度为2 004 bp的基因，命名为‘ K326’，而以SuRB F/SuRB R扩增到序列长度为2 010 bp的基因，命名为‘ K326’(图2)。

图 1 基因枪轰击实验模拟流程图Fig. 1 Flow chart of simulation by gene gun bombardment experiment

A. ‘K326’的ALS基因PCR扩增(M代表DNA 2 000 bp标记; A1-A3均代表SuRA F/SuRA R扩增产物; B1-B3均代表SuRB F/SuRB R扩增产物)。B-C. ‘K326’ALS SuRA和‘K326’ALS SuRB测序结果。A. PCR amplification of ‘K326’ALS gene ( M represents 2 000 bp Marker; A1-A3 represent SuRA F/SuRA R amplification; B1-B3 represent SuRB F/SuRB R amplification). B-C. The product sequencing of ‘K326’ ALS SuRA and ‘K326’ ALS SuRB.图 2 烟草品种‘K326’的ALS基因扩增及PCR产物测序Fig. 2 Amplification of Nicotiana tabacum ‘K326’ALS gene and sequencing of PCR products

2.2 RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合体设计

参照Kochevenko和Willmitzer(2003)的方法，结合‘K326’和‘K326’基因保守序列的比对，设计以‘K326’基因编码区第588位核苷酸由胞嘧啶(cytosine，C)突变为腺嘌呤(adenine，A)的颠换，第1719位核苷酸由鸟嘌呤(guanine，G)突变为胸腺嘧啶(thymine，T)的颠换。针对编码区核苷酸第588位点、 1719位点设计突变碱基的嵌合体分别命名为Chl-588和Chl-1719(图3)。

大写字母为DNA残基; 小写字母为2′-O-RNA残基; 框内字母代表突变位点。Capital letters represent DNA residues; Lowercase letters represent 2′-O-RNA residues; Letters in box represent the mutation sites.图 3 嵌合体RNA/DNA寡聚核苷酸Fig. 3 Chimeric RNA/DNA oligonucleotide

2.3 烟草品种‘K326’愈伤组织诱导及敏感性分析

通过优化的愈伤诱导培养基获得了嫩绿色至淡黄色、结构致密的愈伤组织，可用于后续氯磺隆敏感试验和抗性芽诱导实验。烟草品种‘K326’愈伤组织形成后，接种于含有不同浓度氯磺隆的筛选培养基中生长1周，愈伤组织的颜色从低浓度到高浓度分组颜色由绿色变黄直至黑色(图4)。

A. 烟草愈伤诱导及分化; B. 愈伤组织对不同浓度氯磺隆敏感性响应 (A-H分别为90、100、110、120、130、140、150、160 nmol·L-1氯磺隆)。A. Callus induction and differentiation in tobacco; B. Sensitively response of callus to different concentrations of chlorsulfonon ( A-H represent the concentration of chlorsulfonon 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 nmol·L-1, respectively).图 4 烟草品种‘K326’愈伤组织诱导及氯磺隆敏感性分析Fig. 4 Callus induction of tobacco‘K326’ and sensitivity analysis of chlorsulfuron

在氯磺隆浓度为90、100 nmol·L时，愈伤组织为绿色，生长状态良好；在氯磺隆浓度为110、120、130、140 nmol·L时，愈伤组织颜色为黄色且颜色依次变暗；当氯磺隆浓度达150 nmol·L时，愈伤组织颜色呈棕色，且不继续生长；在氯磺隆浓度达160 nmol·L时，愈伤组织呈黄黑色，逐渐发生褐化现象最后死亡。因此，本研究选择氯磺隆浓度150 nmol·L作为筛选的临界浓度。

2.4 基因枪轰击处理及抗性烟苗获得

参照程义琳等(2013)的方法，结合耿立召等(2005)和宫本贺等(2010)的方法，用包裹金颗粒的RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合体Chl-588和Chl-1719以9 cm的轰击距离、25 inHg的轰击压强对烟草品种‘K326’愈伤组织进行基因枪轰击处理。轰击后的愈伤组织经过恢复培养，氯磺隆筛选分化培养及抗性芽生根培养获得具有氯磺隆抗性的烟草植株22株(图5)。

A. 基因枪轰击后的愈伤组织; B. 在筛选培养基上培养的愈伤组织; C. 筛选出抗性芽; D. 抗性芽生根培养; E. 获得的抗性苗。A. Callus after gene gun bombardment; B. Callus cultured on screening medium; C. Screening resistant buds; D. Root cultivation with resistant buds; E. Resistant plants obtained.图 5 烟草品种‘K326’基因枪遗传转化体系Fig. 5 Process of gene gun gemetic transformed tobacco ‘K326’

2.5 抗性烟苗的ALS酶活性测定

通过对野生型烟草品种‘K326’的ALS酶活性进行不同浓度氯磺隆敏感性检测发现，在氯磺隆浓度为300～500 μmol·L时， ALS酶活性保持最低，在小于300 μmol·L时，随着氯磺隆浓度逐渐降低，ALS酶活性逐渐增强，于是选取310 μmol·L的氯磺隆作为检测ALS酶活性的标准。抗性植株与野生型植株的ALS酶活性检测结果显示，在抗性植株中有8株(Chl-3、Chl-5、Chl-8、Chl-11、Chl-12、Chl-18、Chl-20、Chl-22)的ALS酶活性明显高于野生型的(图6)。因此，推测这8株定点诱变成功的可能性较大。

图 6 氯磺隆对抗性植株和野生型植株的ALS酶活影响Fig. 6 Effects of chlorsulfuron on ALS enzyme activity in resistance and wild-type plants

2.6 抗性烟苗ALS基因突变区序列扩增及测序

利用特异引物，对‘K326’中588位点的保守区及1719位点的保守区进行PCR扩增，产物直接进行测序，扩增产物无杂带(图7)，在上述22个抗性植株中检测到2株发生了特定位点的突变，命名为突变株系f11和b18，前者在588位点发生了C→A的突变，后者在1719位点发生了G→T的突变(图8)。

M. DNA 2 000 bp标记; f1-f9. 扩增含588位点区域; b1-b9. 扩增含1719位点区域。M. DNA 2 000 bp Marker; f1-f9. Amplification with segment containing 588 site; b1-b9. Amplification with segment containing 1719 site. 图 7 含突变位点区段PCR扩增Fig. 7 PCR amplification with segment containing mutation sites

Chl. 抗性植株的测序结果； WT. 野生型的测序结果。Chl. Sequencing result of resistant plants; WT. Sequencing result of wild type plants. 图 8 含突变位点区段测序Fig. 8 Segment sequencing with mutation site

3 讨论与结论

利用生物学手段实现植物体中关键代谢基因的定点突变，能提高植物对除草剂的敏感性，从而提高突变植株对除草剂的抗性，但效率较高的基因定点编辑生物学手段CRISPR/Cas及TALEN技术，在操作的过程中引入了外源基因 (Ishino et al., 1987; Michno et al., 2020)。因此，在转基因作物严格管制的今天难以广泛推广种植。OMM技术理论上不涉及转基因，该技术所得新种质，在种植领域上有其得天独厚的优势。

烟草品种‘K326’基因测序结果发现，该品种基因序列全部为编码区，无内含子序列，从起始密码子至终止子序列完整，而NCBI报道的普通烟草品种与‘K326’品种的基因存在一定差别(Keeler et al., 1993)。NCBI中烟草基因序列长度为2 004 bp，与‘K326’基因序列长度一致；基因序列长度为 1 995 bp，而‘K326’长度为2 010 bp，推测是由品种之间的差异性所致。‘K326’基因与NCBI报道的烟草品种基因尽管序列长度一致，但存在一个碱基的区别，即烟草品种‘K326’基因编码区序列的第831位发生了A到G的简并突变，氨基酸密码子由UUA变成UUG，然而都编码氨基酸Leu，为简并突变，经过多次PCR和重复测序证实结果正确无误，证实这一突变为烟草品种‘K326’本身的差异性。根据‘K326’和‘K326’的保守区，结合Beethan等(1999)、Kochevenko和Willmitzer(2003)的报道，设计了用于‘K326’定点突变的RNA/DNA。

由于Kochevenko和Willmitzer(2003)研究的烟草品种基因并非‘K326’，因此在报道位点上存在位置偏离。为了解决这个问题实验中找到与其完全配对的目标序列，设计突变位点，命名为Chl-588和Chl-1719。在寡聚核苷酸嵌合体设计过程中，为避免嵌合体的不稳定，对片段进行甲基化保护。Yoon等(1996)、Alexeev等(2000)和Bartlett等(2000)的研究发现，RNA/DNA寡聚核苷酸链自身互补形成双链发夹结构，在这种双链结构中，2条互补双链的区别非常明显，其中一条嵌合体链是由5 bp的DNA片段及分别位于该DNA片段两边的10 bp的RNA区域组成，而另一条链全是由DNA构成，利用载体的特殊结构(两组胸腺嘧啶脱氧核苷酸连接互补的两条链，在3′末端的“GC”帽子结构及2′-O-甲基RNA残基)，使其在细胞中具有较好的稳定性。因此，实验设计时采用同样的方法保证在转化过程中的稳定性。

本研究利用基因枪轰击法将定点诱变的RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合体Chl-588和Chl-1719轰击烟草品种‘K326’愈伤组织，定点突变烟草基因，以期得到具有氯磺隆抗性的烟草品种‘K326’植株。耿立召等(2005)提出轰击距离是基因枪转化成功的关键因素，认为基因枪轰击烟草的轰击距离为9 cm。本研究中，探索了基因枪轰击烟草品种‘K326’愈伤组织的轰击距离和轰击压强，结果得出的轰击烟草品种‘K326’愈伤组织的最佳距离与苏宁等(2002)的研究结果一致，这说明在烟草基因枪轰击实验中，轰击条件在不同品种之间差别不大。在氯磺隆筛选过程中，假阳性明显，分化培养基中筛选出的芽在生根培养时大量死亡，本研究认为可能与愈伤组织在含有氯磺隆的培养基中多次继代培养造成的，多次继代培养后使愈伤组织表现了对氯磺隆抗性的假阳性，这一结论与李学宝和毛慧珠(1999)认为的多次继代培养对抗生素产生抗性基本一致。抗性植株ALS酶活性检测结果表明，部分抗性植株的ALS酶活性高于野生型，可以初步说明抗性植株目标位点发生了碱基突变与氨基酸发生了突变，具体要看测序的结果。

通过对抗性植株基因测序，目标位点测序结果表明，在目标位点仅有2株抗性植株发生了定点突变，即发生588位点C到A的突变和1719位点由G到T的突变。但是，由于多数抗性植株并未出现定点突变，因此推测实验结果存在如下可能：(1)烟草染色体为异源四倍体，基因存在2个拷贝(Kochevenko & Willmitzer, 2003)，且2个拷贝之间存在一定程度的差异，在基因扩增及RNA/DNA嵌合体定点诱变上带来一定难度，或是因四倍体在克隆测序时送出的克隆不是突变的那一个拷贝；(2)RNA/DNA嵌合体诱变了其他位点使烟草产生除草剂抗性，烟草AHAS序列的W464位点突变后可以产生抗性，引起植株具有氯磺隆抗性的原因需要进一步去验证；(3)所得诱变植株假阳性概率较高，成功突变的植株较少，Beethan等(1999)、Kochevenko和Willmitzer (2003)的研究也都报道了相似的结果。目前，OMM法的定点诱变在烟草愈伤的诱变条件还处于初步探索阶段。当OMM技术与工程核酸酶TALENs或CRISPR/Cas9一起使用时，观察到的精确无痕基因组编辑的频率显著增加(Sauer et al., 2016)。但是，在编辑的过程中引入外源基因，会使OMM独特的不涉及转基因过程的技术优势荡然无存，所得作物无法大田推广。后期，对OMM技术的优化，以及T1、T2代的检测筛选试验还在不断地探索完善过程中。