我国城乡泡桐丛枝病区域差异因子分析

孔德治, 田国忠, 张文鑫, 王圣洁, 宋传生, 邓宝红,郭民伟, 朴春根, 林彩丽*

(1. 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所,国家林业和草原局森林保护学重点实验室, 北京 100091;2. 中国林业科学研究院热带林业研究所, 广州 510520; 3. 菏泽学院, 菏泽 274015;4. 河南南阳国家农业科技园区, 南阳 473037)

泡桐为泡桐科Paulowniaceae泡桐属Paulownia木本植物[1],是原产于中国且很早被人工栽培利用的优良树种之一,其木材广泛应用于建筑、家具、造纸和乐器等领域。宋代陈翥[2]撰写的《桐谱》为我国首部泡桐科技专著,至今仍具有一定的科学价值。泡桐树态优美、花序大而艳丽;叶大而具毛,净化空气能力强,也是绿化城市和工矿区及庭院、乡村四旁的好树种[3]。

泡桐丛枝病是由植原体引起的一种危害严重的林木病害。植原体专性寄生于泡桐韧皮部筛管内,引起腋芽和不定芽大量萌发,节间缩短,花器变态,叶片黄化等症状。1967年日本DOI等[4]首次发现这类新病原,20世纪70至80年代金开璇等[5]和Joon等[6]学者分别证实了发生在中国和韩国的泡桐丛枝病为同一病原,此后许多学者针对泡桐丛枝病的发生规律与防治技术等方面进一步开展研究,明确了该病害是通过种根、种苗等营养繁殖材料和媒介昆虫进行传播[7-10]。20世纪60年代以来,我国曾大规模开展泡桐造林,但这一过程也造成了泡桐丛枝病的暴发与流行。经调查统计,泡桐丛枝病在重病区发病率可超过80%,而且随着泡桐树龄的增加,发病率呈上升趋势[11]。迄今在北至山海关、南至长江流域的广大范围内,有19个省、直辖市、自治区报道有泡桐丛枝病发生,发生面积22 252.6 hm2,给泡桐的生产带来了重大危害与损失[12-13]。在病害防治方面,20世纪90年代建立的温度处理结合茎尖培养组培脱毒、PCR检测技术和脱毒组培苗快繁技术为解决种根和种苗传病问题提供了有效解决方案[14]。

此前针对该病害发生与危害的详细调查数据多集中在局部的重病区与用材林人工栽培区,全国性调研与区域间比较的数据甚少,仅有崔晓琦等[15]使用经纬网格布点法选点调查该病害的地理变异规律的一篇研究报道,或作为泡桐种类资源调查的辅助调研内容,其研究也缺乏病原分子检测与鉴定技术佐证;而针对城市市区泡桐丛枝病的发生状况,仅有北京和郑州两市的文献报道[15-16]。虽然近些年来于少帅等[17]、宋传生等[18]对16Sr I组植原体特别是泡桐丛枝植原体株系的分子变异研究报道,但尚不确定我国泡桐丛枝植原体中是否存在不同致病力菌株。

2018年3月至2020年11月在黄淮海、西北、西南和江南四大区域内选取代表性的泡桐种植调查点,对泡桐丛枝病开展普查和典型调查研究,采集发病泡桐样品进行外植体组织培养和植原体检测。以期通过研究获得关于该病害的最新扩散与危害信息,揭示不同泡桐种类和地理环境等相关因子对病害区域分布、扩散和危害程度的影响,解析导致我国泡桐丛枝病危害程度地域差异的原因,为不同区划制定更有针对性的病害预防和治理对策奠定基础。

1 材料与方法

1.1 泡桐种的分类与识别

参考相关泡桐专著识别的泡桐种类包括白花泡桐Paulowniafortunei、兰考泡桐P.elongata、毛泡桐P.tomentosa、楸叶泡桐P.catalpifolia、台湾泡桐P.taiwaniana、华东泡桐P.kawakamii、山明泡桐P.lamprophylla、川泡桐P.fargesii、鄂川泡桐P.albiphloea、成都泡桐P.albiphloeavar.chengtuensis及部分中间类型,无法识别的中间类型统一归为天然或人工杂交种类或无性系,部分未识别类型归为未知型[19-21]。

泡桐优良品种(系)3个:ZL-3为白花泡桐×毛泡桐天然杂交种P.fortunei×P.tomentosa、XUH为宿县毛泡桐优系P.tomentosa、C020为白花泡桐优系P.fortunei。

1.2 调查地点和方法

在《泡桐栽培学》[3]中我国泡桐分布区的基础上划分为4个区域:黄淮海暖温区、西北干旱区、西南亚湿热区和江南温暖湿润区;分别在其中选取代表性调查点分布于16个省的37个市(县);调查地点分为城区、郊区、县域及乡镇;栽植类型包括散植、集中栽植、行道树或片林。采用重点样地调查与随机踏查相结合的方式,对不同地区泡桐栽植点2年以上树龄的泡桐发生丛枝病情况进行普查,逐株记载树龄(部分估测)、丛枝病株和丛枝病严重程度,并考察栽植方式和立地条件。

1.3 病情分级与病情指数计算

在李荣幸等[22]的野外泡桐发病严重程度分级标准的基础上进一步优化,共划分为5个等级。0级:健康无症;Ⅰ级:仅有1～2个小的丛枝,占树冠的10%以下;Ⅱ级:有1～2个大的丛枝或较多小丛枝,占树冠的10%～20%;Ⅲ级:有2个以上大的丛枝,占树冠的20%～50%;Ⅳ级:有多个大的丛枝或整株丛枝,占树冠的50%以上。

对组培条件下培育4个月以上的13组带菌泡桐组培苗按发病严重程度不同共分为5个等级。0级:健康无症;1级:小叶占全株的10%以下;2级:小叶占全株的10%～50%;3级:小叶占全株的50%以上;4级:小叶占全株的50%以上且顶芽出现膨大,植株分化受抑制。

发病率和病情指数的计算公式:

选取年均温度、降水量、湿润度、干燥度、≥0℃积温、≥10℃积温和太阳辐射强度7个气候因子,所有气候数据来源于1980年-2015年全国气象站观测数据,通过整理、计算和空间插值处理生成。气候数据的插值应用澳大利亚的ANUSPLIN插值软件,ANUSPLIN是一种采用平滑样条函数对多变量数据进行分析和插值的工具,能够对数据进行合理的统计分析和数据诊断,并可以对数据的空间分布进行分析进而实现空间插值的功能[23]。插值后根据调查样点的经纬度利用ArcGIS 10.4提取各调查样点的气候因子数据。用Excel、SPSS 26.0软件对泡桐丛枝病病情指数与气候因子数据进行相关分析和回归分析。

1.4 休眠枝水培与外植体组织培养

野外采集休眠泡桐发病枝条,长度为36～50 cm,用自来水进行表面洗涤,之后放入口径25 cm、高26 cm的10 L的塑料桶内,并加入适量清水,在温室内25℃连续光照下水培促其萌芽,每7 d更换桶内清水。

外植体组培:剪取在温室内水培30～60 d后泡桐休眠病枝萌发的幼嫩新芽(去掉叶片),自来水冲洗2 h,75%乙醇处理30 s,0.1%升汞溶液中消毒5～15 min,用灭菌水洗涤后,截成2～3 cm具节茎段,接种于固体MS基础培养基上,于25℃组培室内培养,光照时间14 h/d,光照强度15 00～2 000 lx。15 d至1个月间隔转接至新培养基上,之后在1～2个月间隔内继代培养1次。

1.5 DNA提取与病原检测方法

植物总DNA的提取,参照CTAB法植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司,DN14)说明书稍加改动。取待测泡桐新鲜组织约0.3 g或干组织约0.1 g,抽提植物总DNA,并将其保存于-20℃备用。以植原体16S rDNA基因引物对R16mF2/R16mR1和R16F2/R16R2[24-25](北京六合华大基因有限责任公司合成),进行直接PCR和巢式PCR,PCR扩增体系及反应条件参考Gundersen等[24]、Lee等[25]的方法。阳性对照为本实验室保存的泡桐丛枝植原体病株DNA,阴性对照为健康泡桐植株DNA,空白对照为DEPC处理的无菌超纯水。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,直接PCR和巢式PCR预期片段长度分别为1.4 kb和1.2 kb。LAMP检测采用王圣洁等[26]报道的方法进行,LAMP扩增的引物包括正向外引物PaWB-F3、反向外引物PaWB-B3、正向内引物PaWB-FIP、反向内引物PaWB-BIP(生工生物工程上海股份有限公司合成)(表1)。

2 结果与分析

2.1 我国部分城乡地区泡桐丛枝病分布与发生危害趋势

2018年-2020年对我国4大泡桐分布区内选取的37个代表性城市与乡镇的泡桐丛枝病病害调查结果显示,黄淮海暖温区和西北干旱区是该病害发生的重病区,西南亚湿热区次之,江南温暖湿润区最轻(表2)。由南向北,该病害整体呈现加重趋势,这一结果与之前积累的调查数据相吻合(未发表数据)。本研究首次对云、贵、川的西南地区随机抽样调查结果显示,这一大区的发病率和危害程度都在中等程度。而在湖南省郴州市莽山以南的地区,泡桐树为零星分布,未发现泡桐丛枝病危害。

本次调查数据也显示了一些与以往报道不同的病害危害状况与变化趋势。在黄淮海传统重病区的河南商丘市和开封市局部地区集中栽植的中幼龄泡桐、山东青岛和日照市城乡散植的成年泡桐丛枝病发病率和病情指数都明显较低。而在西北干旱区的山西局部地区则病害有加重的趋势,其中临汾汾河生态公园集中栽植的泡桐和交城县城栽植的行道树发病率与病情指数都很高。对福建福州、南平与河南商丘分别进行的两次动态病害调查分析,其发病程度均呈现逐年加重的趋势,表明处于毒源附近的中、幼林的整体病害发展较快。

在一般情况下,同一地区的主城区与郊县、乡镇的泡桐丛枝病总体发病率和危害程度存在大体一致性,即城区危害重的其郊区乡镇也偏重,反之亦然。但是当地较大规模集中栽植于特定环境、不同树龄或不同种的片林局部发病状况会呈现特殊性,显著重于或轻于当地的平均严重程度。该病害严重破坏树木干型、冠型、开花和绿化美化及空气净化能力,且发病树龄越大危害越重。北方城区散植20～30年以上树龄的泡桐多为兰考泡桐,其病树的病级常低于同种中幼龄病株病级,似乎表现出一定的成年株抗病或耐病特性。

表2 2018年-2020年中国部分地区泡桐丛枝病病情调查结果

续表2 Table 2(Continued)

2.2 不同种的泡桐感病性和丛枝症状多样性观察

野外踏查发现我国长江以南地区白花泡桐分布最普遍、其次为台湾泡桐和华东泡桐。本研究首次发现在福州市福道景区集中人工栽植的台湾泡桐发病较重,表现为发病率高和丛枝症状重,而白花泡桐发病相对较轻(病枝多发生在树冠内膛枝，节间缩短和小叶程度较轻);进一步对福建福州、南平,湖南衡阳和郴州的调查结果都显示了台湾泡桐比白花泡桐更感病;但在贵州遵义栽植的这两种泡桐的感病程度差异减小(表3)。西南亚湿热区有白花泡桐、华东泡桐、鄂川泡桐、台湾泡桐和川泡桐分布,成都市区主要为鄂川泡桐、川泡桐和成都泡桐,昆明市区的台湾泡桐和川泡桐比例较高。这一区域川泡桐似乎更感病,而白花泡桐、华东泡桐等感病程度较轻。

表3 白花泡桐与台湾泡桐丛枝病调查结果

在田间踏查时发现部分染病泡桐存在越季(秋季)异常开花的现象,即在泡桐当年生长的10月-11月正常花蕾发育完成阶段,病树上的正常发育花蕾当年提早开放,花冠正常;而健康植株的花蕾要次年春季才能正常开花。已发现这种现象的地区有浙江杭州、江西上饶、山西临汾、河南南阳、开封、河北保定、北京等地区,泡桐种类包括毛泡桐、兰考泡桐、白花泡桐及杂交泡桐等。初步观察发现越季开花与丛枝病发生之间存在着很高的相关性,即出现越季开花的泡桐树几乎皆为丛枝病株;但一般表现严重丛枝和变叶的病株或病枝上,因无正常花蕾发育,故无越季开花可能;而最常见的状况是靠近丛枝的无症枝、或大病枝上的小无症枝,或出现小病枝的大无症枝上出现越季开花现象(图1)。

图1 泡桐丛枝病病株上的越季异常开花(拍摄于2019年11月,山西临汾)Fig.1 Off-season blooming of the diseased paulownia tree associated with phytoplasma infection (Photographed in November 2019 in Linfen of Shanxi province)

2.3 气候因子与泡桐丛枝病相关性分析

双变量线性回归分析结果(图2)显示,泡桐丛枝病发病率和病情指数与温度相关因子年均温度、≥0℃积温和≥10℃积温、水分相关因子年均降水量、湿润度和干燥度及日均太阳辐射强度共7个气候因子相关性均达到显著水平。发病率和病情指数与年均温度、年均降水量、湿润度、≥0℃积温、≥10℃积温呈负相关关系;与干燥度、日均太阳辐射强度呈正相关关系。采用逐步回归法分析得出,病情指数与7个气候因子中年均降水量相关性最高,R2为0.579,P<0.001,F值(方差检验)为57.69。

线性回归方程预测,年均温低于14℃时,病害发生严重;年均温高于19℃时,病害普遍较轻;年均降水低于610 mm时,病害发生严重;年均降水高于1 450 mm时,病害普遍较轻。在回归方程的散点图中,乡镇与人工林的坐标点多数离散值较大。

2.4 不同生境与栽植方式下病害发生情况

对重病区的河南和山西的片林与集中栽植林地的病害调查结果显示,因生境、栽植方式、树龄、种类等不同而导致的病害发病率和病情指数的差异很大。随着树龄增大,发病率与病情指数均明显加重,比如河南商丘黄河故道森林公园生长20年以上的纯林发病率达94.6%,病情指数达56.1,这与以往报道结果类似。一些绿化工程造林地病害严重程度较高,比如山西临汾和交城;但另一些造林工程地中幼林的发病程度则比以往报道的同龄林明显减轻,比如河南兰考泡桐森林公园、民权森林公园、商丘森源驾校等。对本实验室前期栽种的泡桐脱毒苗示范林地的追踪调查结果显示(表4),脱毒苗在南方造林地比北方造林地丛枝病明显减轻;在黄淮海暖温区南阳,宿县毛泡桐(XUH)抗病性表现明显强于感病‘中林3号’泡桐无性系(ZL-3),但随着树龄的增大,宿县毛泡桐的病情也在逐渐加重。

2.5 不同地区、不同种类泡桐休眠病枝水培萌条检测与外植体组织培养观察

从17个泡桐休眠病枝水培萌芽样品中(表5),直接PCR共检出11个植原体感染阳性样品(图3);用巢式PCR进一步检出2个阳性样品;LAMP共检出13个样品(图4);泡桐休眠病枝萌发新芽的植原体综合检出率为76.5%。根据对泡桐休眠期采集的泡桐丛枝的病原检测、组培症状观察结果判断各地采集的离体越冬休眠枝水培萌芽仍携带存活植原体,进一步验证也支持了泡桐丛枝植原体可在地上部成活越冬,而不必下行至根部越冬的观点。

图2 泡桐丛枝病病情指数与气候因子线性回归分析Fig.2 Linear regression analysis between disease index of paulownia witches’-broom disease and climatic factors

表4 泡桐脱毒苗造林丛枝病调查1)

表5 野外采集泡桐越冬休眠丛枝室内水培萌芽植原体检测1)

图3 泡桐丛枝病样品的直接PCR和巢式PCR检测Fig.3 Detection of PaWB samples by direct PCR and nest-PCR

通过对休眠病枝萌芽外植体的组织培养,成功获得了来自福建、四川、江苏、山西、陕西5个省份共计13组带菌泡桐组培苗。连续继代培养后,对不同地理来源、不同种类泡桐的组培苗症状严重度进行比较(表6),结果显示除陕西省西安市兴庆宫楸叶泡桐病情指数相对较低(32.2)外,其他来源组培苗的发病率和病情指数皆很高,分别达93.3%～100%和52.1～76.9;不同种类泡桐单株组培苗症状对比发现,白花泡桐和楸叶泡桐症状相对较轻(3级),台湾泡桐、兰考泡桐、毛泡桐和陕桐均能达到4级。来自不同地区的发病泡桐经组培继代后,组培苗的发病症状均高于田间自然条件下生长的泡桐,尤其是来自福建的组培苗与田间生长的泡桐发病症状差异最明显。

图4 泡桐丛枝病样品的LAMP检测Fig.4 Detection of PaWB samples with LAMP

表6 来源于不同地区感染植原体的不同种类泡桐组培病苗连续继代培养症状严重度观测

3 讨论

本研究首次尝试将我国泡桐丛枝病根据严重程度和气候类型划分为4个不同区域;特别关注和比较了城区与郊区乡镇四旁及其他人工泡桐林丛枝病害的发生特点;初步解析了我国泡桐丛枝病南方轻、北方重的可能原因,将关键因子聚焦到了气候、寄主抗性、种苗带菌等因素。这些研究结果将为针对不同生境的泡桐丛枝病制定综合防控策略与科学决策提供理论依据。

总体来看,与20世纪60至80年代我国泡桐丛枝病大发生期相比,现阶段的病害发生处于相对平稳状态,许多泡桐主栽区中幼龄泡桐病害发生与受害明显减轻,1～3年生幼林发病率低至0～5%(以往报道在2%～30%);江南地区未出现大规模、区域性的暴发和流行。但黄淮海暖温区和西北干旱地区成年泡桐发病总体上仍较为严重[5,27-29]。在京津冀地区实地踏查发现有白花泡桐的分布,且黄淮海地区的病害普遍高于长江流域的湖北地区,补充修正了崔晓琦等的研究结果[15]。长江以南,岭南以北的江西、湖南、福建等省份总体为零星病区,该地区主栽的白花泡桐病害发生很轻;但也发现局部栽植较多的台湾泡桐丛枝病相对较重。关于福建省泡桐丛枝病的记录,最早见于1980年金开璇[27]的报道,但在《中国林业有害生物: 2014-2017年全国林业有害生物普查成果》中福建未被列为分布区[14],本研究则进一步明确了福建为病害零星分布区。据文献报道,与福建隔海相望的台湾岛在1974年即报道了在台湾泡桐P.taiwaniana和白花泡桐P.fortunei有丛枝病的发生,且蔓延较快,其中白花泡桐较耐病[9]。此前对西南地区该病发生和流行学调研数据和文献报道很少,本次调查填补了这方面的空白,并发现该地区川泡桐发病严重,而贵州贵阳和遵义市区白花泡桐的感病程度相比江南地区较重,这是否为不同生境对其感病性产生了影响尚待证实。

在泡桐抗病性研究方面,以往研究报道证实泡桐属内不同种间及部分选育推广优良品系,包括优选无性系和杂交种都存在着对丛枝病自然抗病与感病的差异[9,22,30-31]。其中毛泡桐‘C161’和‘毛杂16’具有对丛枝病的高度抗性,‘豫杂1号’‘陕桐4号’‘苏桐3号’等选育品系也具有较强的抗丛枝病能力,这些相对抗病或耐病品系在重病区的普遍栽种会对病情起到一定的减缓作用[30-34]。在重病区的河南、山东、山西、陕西等地,采用当地传统种根育苗常会导致苗期1%～5%发病率,乃至更高比率的无症带菌苗;而大量带菌茶翅蝽Halyomorphahalys(Stål)的若虫和成虫阶段持续的传毒作用是丛枝病病情指数随树龄增加而逐年递增的主要原因[10]。在河南省重病区大力推广脱毒育苗技术杜绝了苗木的带菌现象,且明显降低了中幼龄泡桐的病情[35],但感病无性系‘中林3号’造林4～7年以后发病率和病情指数都快速升高,而抗病的宿县毛泡桐定植12年内病情维持在较低水平[30,35-37]。

在环境条件方面,通过对泡桐丛枝病病情指数与气候因子间的相关分析和回归分析显示,年均降水量、温度两大因子与病害都具有较高的相关性,但不同环境变量的作用方式和机制还需要更严格的试验论证与数据支持。通过对发病泡桐的组培苗症状观察发现,来自江南和西北的同种泡桐组培苗症状差异不明显,而田间生长的同种泡桐症状差异明显。结果进一步说明气候因子是造成不同分布区泡桐发病程度差异的主要因素之一。在南方病害零星发生区,侵染源要远少于北方重病区,并且相对抗病与耐病的白花泡桐分布较普遍,但是否会因南方降水量增加和温度偏高而导致传病介体缺乏、种群密度或传病效率低而减少了感染几率也是值得研究的课题。泡桐在城镇生活区、农桐间作区、人工林区和自然保护区的种植方式和环境因素差异巨大,病害发生必然受到影响,如城镇生活区的高大建筑物、其他植被的隔离效应等对病害传播起到一定的抑制作用。另外有研究发现土壤因子,特别是磷、钾等元素含量及施肥与泡桐丛枝病的发生与发展有密切的相关性[38-39]。

Thébaud等[40]根据对法国克罗平原发生的欧洲核果黄化病风险因子的调查研究,认为对人为有关的可控风险因子的有效控制是降低发病率与病情的经济环保的防控措施。依据本研究结果,我们认为泡桐丛枝病防治应针对病害不同区划采取有差别的防控对策。既要加强营林管理、及时修剪发病枝条以减少毒源和降低病害发生的风险,也要严格把控带菌苗木的检测和因地制宜选用适度抗病泡桐种类和品系。在城市绿化美化中推荐抗病、抗污染、空气净化能力强、树型与枝叶优美、寿命长的种类。采用泡桐脱毒苗与其他非寄主树种间种等方法物理防治丛枝病,并倡导在无病或发病很轻的地区建立脱毒苗木繁育生产基地。