千年桐雌雄株间形态及生理学差异研究

毛 霞，李晓春，刘国华，陈 刚★

（1.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400；2.宜春市科学院，江西 宜春 336000）

千年桐（Vernicia montana）又称木油桐是大戟科（Euphorbiaceae）油桐属（Vernicia）落叶乔木，原产于我国，种植范围比较广泛，栽培历史悠久[1]。由于其果皮基部呈皱状褶皱，经济价值高且使用寿命相对较长，因此而得名皱桐，又称木千年桐、广东千年桐、金臣树。千年桐是重要的油料植物，其干种子的含油量大约为60%~70%，极具能源开发应用前景，能发展成生物质能源林，被认为是最理想的替代柴油的微量生物化学原料之一[2-3]。在生物量生长方面，千年桐具有生长快，耐寒等优秀品质，作为用材树种具有良好的研发潜能[4-5]。但是，我国对于千年桐能源树种的资源相对较少，桐油在国际市场上供不应求，而且桐油的主要用途和覆盖面广大，提高千年桐单位面积产量已显得十分迫切[6-7]。

千年桐作为雌雄异株植物，约有1/3的植株不结果[1]。在生产上，不结果的雄株比重过大严重影响单位面积产量的提高，因此在配置前期如何识别千年桐幼苗的雌雄，是当前千年桐种植和生产上亟需解决的问题。早期相关学者对千年桐雌雄植株的生理指标、酶活性进行了测定；同时，利用化学染色法对千年桐成年植株的雌雄进行鉴定[8-11]。近年来，对于木本雌、雄异株植物的生物学差异研究主要从雌、雄株的形态解剖学[12-13]、生理学[14-15]、分子生物学[16-17]、化学防御[18-19]以及激素对性别的调控[20]等方面进行，为雌、雄株在生产实践中的选择性应用及理论研究提供参考[21]。而形态学研究是生化分析取样的基础，有助于植物早期雌雄的鉴定，也是鉴别植物雌雄最直观、最直接的方法。相关研究表明树龄较大的乳香黄连木（Pistacia lentiscus）雄株植株较高，冠层体积和叶面积指数值较大[22]；连香树(Cercidiphyllum japonicum)雄株叶长、叶宽等都高于雌株[23]。

文章对不同千年桐天然林分进行踏查，研究不同海拔林分形态指标的差异，并且以天然林成年千年桐的雌、雄株为试验材料，研究了雌雄株在形态及生理学上的差异，旨在为千年桐的保护和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于江西省宜春市明月山，地处江西省宜春市袁州区西北部（27°54′N，114°18′E），属中亚热带季风型湿润气候区，气候资源丰富，年平均气温12℃~15℃，无霜期307 d，雨量充沛，年降水量1 500~1 800 mm；光热丰富，年日照时数1 400~1 900 h，气候类型多样，境内地势高低不一。

1.2 试验材料与样品采集

试验调查了位于袁州区的6个天然千年桐群落，每个林分单株数量在50~300株之间。选取的调查对象为5月处于开花期的千年桐雌雄单株。

于2020年5月13日进行采样，选取的材料为样地吼里布村中8年生的已开花的生长健康、无病虫害的千年桐雌雄株各30株（雌株：♀；雄株：♂），随机选取每个植株向南面生长健康、无病虫害的叶片5片及离叶片上下各5 cm处的韧皮部，宽度为5 cm。将采回的叶片、韧皮部，洗净、擦干装入含有吸水硅珠的自封袋中，置于－80℃超低温冰箱保存。

1.3 试验方法

1.3.1 千年桐雌雄株野外调查

对天然千年桐群体主要分布区（江西省宜春市袁州区）人为干扰较少的河岸带进行种群调查。在千年桐每个主要分布区均设置5个20 m×30 m的样方，各样方间隔20 m，于千年桐花期对所有能区分雌雄的千年桐植株进行标记，并通过成对取样法选定生长状况良好、无病虫害的雌雄单株，在2020年11月对植株进行胸径（胸径尺）、冠幅（冠层仪塞亚斯SYSGC2000）、树高（测高仪雷力SLD-300G）、树龄（生物锥法）的测定。

1.3.2 指标测定

可溶性糖和淀粉含量的测定采用蒽酮测试法[24]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝比色法[24]；SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[24]；POD活性采用愈创木酚法测定[25]。

1.4 数据统计与处理

使用Excel 2016和Origin 2017进行数据统计、作图分析。雌雄比偏离1∶1假设的显著性程度采用卡方检验确定；用单因素方差分析检验组间差异显著性，上述分析使用SPSS 20.0完成。表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 天然千年桐林分种群雌雄比

本次踏查了6个地区（表1），处于花期的千年桐单株共计316棵，其中雌株共113棵，占比35.75%；雄株共203棵，占比62.24%，雌雄比为0.63±0.29，总群体显著偏雄（χ2=18.00，P＜0.01）。根据调查结果发现，每个千年桐天然林样地中，雄性单株数量均多于雌性单株数量，其中石溪水库、水口村和袁梅村的雌雄比显著偏离1∶1，雄株偏多，χ2值分别于11.08（P＜0.01）、25.79（P＜0.01）、4.41（P＜0.01）；仅东坝冲的天然林中雌雄株数量相同。

表1 千年桐天然林各样地雌雄株结构参数Tab.1 Structural parameters of male and female plants in each site of natural forest of V.montana

2.2 千年桐雌雄株形态学差异

雌雄异株植物是自然生态系统的重要组成部分，由于雌雄个体对环境的适应性不同而导致二者在生理、形态、生活史以及群体结构上存在差异。但由表2可以看出，同一踏查地的千年桐的胸径、树高、冠幅、树龄在雌雄植株间差异不显著（P＞0.05）。尽管里木地区千年桐雌雄株的冠幅均值相差较大（♀：14.79±7.50m；♂：23.45±17.76m），但差异不显著（P＞0.05），说明里木的千年桐群体间个体差异较大。表2中6个踏查地的千年桐雌雄株的树龄按照均值从大到小排序为：里木、水口村、袁梅村、东冲坝、吼里布村、石溪水库，由此可见里木群体间个体差异较大的原因可能是由于存在大龄植株。

表2 天然千年桐林分雌雄单株信息表Tab.2 Information table of male and female monocultures in natural forest stands of V.montana

以不同踏查地为研究对象，发现千年桐雌雄株形态指标存在差异，推测导致这一结果的原因是受到了土壤条件、气候条件、人为干扰条件等的影响；其中里木、水口村、袁梅村的胸径、冠幅、树高的均值，均高于其他3个踏查地，可能与群体间年龄相关性较大。

2.3 天然千年桐林分雌雄株形态指标相关性分析

由前述可知，不同踏查地的海拔存在差异，林分间形态指标也存在差异，推测可能与生境、树龄存在相关性。由此对海拔、植株数量、胸径、冠幅、树高、树龄指标进行相关性分析（表3），可以看出千年桐雌雄植株间的形态指标相关性存在差异，且各形态指标、树龄、海拔间两两相关。

表3 千年桐雄株形态指标、树龄及海拔间的两两相关性Tab.3 Correlation between morphological indicators of V.Montana

千年桐雌株的数量与海拔、形态指标、树龄两两之间相关性差异不显著。对雌株的形态指标与海拔的相关性分析中，仅树高与海拔相关性不显著（P＞0.05），其中胸径、冠幅、树龄均与海拔呈负相关性，且差异极显著（P＜0.01）；植株数量与千年桐形态指标的相关性不显著；而胸径、树高、年龄两两相关性均为正相关，且差异极显著（P＜0.01）。

雄株的数量仅与树龄无相关性，与胸径、冠幅均呈正相关，差异极显著（P＜0.01）；与树高呈负相关（P＜0.05）。对雄株的形态指标与海拔的相关性分析中，仅冠幅与海拔相关性不显著（P＞0.05），与其他形态指标均为正相关（P＜0.01）。与雌株不同的是，雄株的数量与千年桐的胸径、冠幅、树高均呈正相关性（P＜0.01）；千年桐其他形态指标两两相关性也均呈正相关（P＜0.01）。

综上，千年桐雌雄株形态指标、海拔、树龄间的相关性根据雌雄不同而存在差异；同性植株的胸径、树冠、树高两两相关性均为极显著的正相关（P＜0.01）。

2.4 千年桐雌雄株养分含量差异研究

由图1可知，千年桐雌雄植株叶片中的养分含量均差异显著（P＜0.05），且千年桐雌株的叶片中可溶性糖含量及淀粉含量均显著高于雄株叶片的含量；而叶片可溶性蛋白含量则为雄株＞雌株。千年桐雌雄植株的韧皮部养分中仅可溶性蛋白含量存在显著差异（P＜0.05）。

图1 千年桐雌雄株不同组织养分含量差异Fig.1 Differences in nutrient contents of different tissues of male and female plants of V.Montana

对于同性不同组织中养分含量的差异而言，仅雌株中可溶性糖含量及可溶性蛋白含量存在差异显著（P＜0.05），雄株的叶片及韧皮部养分均差异不显著（P＞0.05）；并且均表现为同性中叶片养分含量高于韧皮部中养分含量。

2.5 千年桐雌雄株酶活性差异研究

由图2可知，千年桐雌雄株的叶片中各类酶的酶活性均为雌株＞雄株，但仅POD、CAT酶活性存在显著差异（P＜0.05），其中雌株叶片中POD酶活性（183.09±21.44 U/mg prot）远大于雄株中POD酶活性（59.95±18.02 U/mg prot）。对于植株的韧皮部而言，雌株中各类酶的酶活性均高于雄株，但仅SOD、POD酶活性在雌雄株中存在显著差异（P＜0.05），且雌株的韧皮部中POD酶活性（179.95±31.42 U/mg prot）远大于雄株（73.12±25.71 U/mg prot）。

图2 千年桐雌雄株不同酶活性差异Fig.2 Differences in the activity of different enzymes of different tissues of male and female plants of V.Montana

通过比较同性不同组织中酶活性发现，雄株的叶片及韧皮部中仅MDA含量存在显著差异（P＜0.05），其他酶活均差异不显著（P＞0.05）；雌株的叶片及韧皮部中仅CAT含量存在显著差异（P＜0.05），其他酶活均差异不显著（P＞0.05）。

3 结论与讨论

3.1 千年桐种群的雌雄比结构

雌雄异株植物种群性别间的偏倚可能直接影响种群的繁育过程，造成有性生殖效率降低，进而可能改变植物种群的性别结构和动态[26-27]。现有理论认为大多数雌雄异株植物雌雄比偏雌更为常见[28-30]，如对细枝柃（Eurya loquaiana）的研究发现其雌雄比为1.43[31]。本文研究表明：每个千年桐天然林样地中，雄性单株数量均多于雌性单株数量，其中石溪水库、水口村和袁梅村的雌雄比显著偏离1∶1，植株偏雄。有学者认为长寿命的灌木和乔木的种群性比通常偏向于雄，对黄连木（Pistacia chinensis）的研究也体现了种群性比更加偏向雄[32]，与本文研究一致。引起种群中雌雄异株植物性别依赖的繁殖差异可能由于雌树付出的繁殖代价高于雄树，以致种群性比偏雄性。同时，对青杨（Populus cathayana）的研究表明雌雄株性比随海拔梯度的增加而增加[33]，也可能是石溪水库、水口村种群雌雄比显著偏离1∶1的原因。

雌树通过降低营养生长将更多的生物量分配于繁殖过程，因此同一植物种群雄树的平均胸径通常大于雌树[29]；而同一踏查地的千年桐胸径、树高、冠幅、树龄在不同性别的植株间差异不显著（P＞0.05），可能与千年桐植株的树龄较小、雌雄分化尚不显著相关。同时，林分密度、发育环境的物理性质及气候变异等均会导致种群性比发生改变[33-37]。

3.2 千年桐雌雄株间形态学差异

同一踏查地千年桐的胸径、树高、冠幅、树龄在雌雄植株间差异不显著（P＞0.05），对连香树的研究中也表明性别对其胸径无显著影响，但对株高有显著影响[38]。不同踏查地的海拔存在差异，林分间形态指标也存在差异。对海拔、植株数量、胸径、冠幅、树高、树龄指标进行相关性分析可以看出，千年桐雌雄株的数量均与海拔呈正相关，而与树龄无相关性。王志峰等[39]对青杨不同海拔雌雄株数比较发现，随着海拔的变化，雌雄群体会选择最适合自身生长的环境进行繁殖，低海拔地区雌株占优势，雄株在高海拔地区占优势。与上述结论存在相悖性，可能是由于群体结构的年轻化，导致植株的数量属于增长型；而对细枝柃的研究中也发现，在一个增长型种群内，株数会随着龄级的增加而增加[40]。

3.3 千年桐雌雄株生理学差异

雌雄异株植物的雌雄个体对环境的反应各不相同，表现为生长、生物量、抗氧化防御酶活性等，其中碳水化合物是植物细胞中各种物质的碳架提供者，也是能量的携带者。本研究发现千年桐叶片中不同性别植株的养分含量均差异显著（P＜0.05），且千年桐雌株的叶片中可溶性糖含量及淀粉含量均显著高于雄株叶片的含量；千年桐不同性别植株的韧皮部养分中仅可溶性蛋白含量存在显著差异（P＜0.05）。对黄连木的研究发现，雄株叶片积累的同化物较雌株叶片高，与本文研究结果相反[41]。可能由于养分的“库-源”关系，在生长期中雌株叶片养分需运输给果实和根系两个库器官；而雄株叶片养分仅需运输给根系一个库器官，导致开花期前雌株积累的同化物较雄株高，以满足植株的繁殖发育。

可溶性蛋白是植物原生质体内最丰富的有机物，是重要的渗透调节物质和营养物质。本研究表明千年桐植株叶片的可溶性蛋白含量雄株＞雌株，与王小燕等[41]对黄连木雌雄株间可溶性蛋白含量差异研究结论一致，但与强晓霞[42]对大麻（Cannabis sativa）叶片雌雄间可溶性蛋白含量差异研究结论相反。这表明多数雌雄异株植物在生理生化代谢过程中存在差异，雌雄株的代谢水平可能不同。

相关研究表明匍匐柳（Salix repens）和深山柳（Salix reinii）雌株POD活性高于雄株，雌株比雄株的防御能力强，但青柳（Rhipsalis cereuscula）雄株的SOP、POD的活性显著高于雌株[43]。本研究中千年桐雌雄株的叶片各类酶的酶活性均为雌株＞雄株，但仅POD、CAT酶活性存在显著差异（P＜0.05），与软枣猕猴桃(Actinidia arguta）雌雄株叶片酶活研究结论一致[44]。强晓霞[42]研究则认为POD活性与雌性分化相关，CAT活性与雄性分化相关，从而叶片中CAT活性均在雄性植株中较高，POD活性则相反；与苦瓜（Momordica charantia）的研究结论一致[45]。对黄檗（Phellodendron amurense）的研究发现不同时间段雌雄株间酶活差异不同，在6-8月，雄株大于雌株；9月为雌株大于雄株[46]。说明雌雄株在不同的生长期内，其抗氧化防御能力、保护细胞免受氧化损失能力也不同。

虽然这些研究表明雌、雄株之间在生理生化方面存在一定的差异，但这些研究的对象仍然是成熟植株，而对于未成熟植株，仍然没有一个明确区分雌、雄株的固定的方法，此方法也只能是在植物雌雄鉴定中作为一种辅助鉴别的证据。