一个Ellis-van Creveld综合征家系的遗传分析及产前诊断

王金铭,霍晓东,杨 科,吴 东,郭正隆,王睿丽,刘冰冰,贾晓灿,雷星星,王 鑫,单慧慧,郝冰涛,廖世秀

1)河南省人民医院(郑州大学人民医院)医学遗传研究所；河南省遗传性疾病功能基因组重点实验室；国家卫生健康委员会出生缺陷预防重点实验室 郑州 450000 2)河南省人民医院超声科 郑州 450000 3)郑州大学公共卫生学院计算机与卫生统计学教研室 郑州 450001

Ellis-van Creveld综合征(Ellis-van Creveld syndrome，EVC)又名中外胚层发育不全、埃利伟氏症候群、六指侏儒症、多指和软骨发育不良，是一种骨骼发育不良疾病[1-3]。其特征性的临床表现有短肢、短肋骨、轴后多指、发育不良的指甲和牙齿，60%的患者存在先天性心脏缺陷，最常见的是原发房间隔造成的心房缺陷[4]。EVC在新生儿中的发病率为7/100 000，在美国的阿米什民族中甚至高达1/200[3]。2021年1月，我们采集了1例孕18周、产前超声发现多发畸形胎儿孕妇的羊水标本，对羊水细胞进行染色体G显带核型分析，结合胎儿父母血样的基因测序结果，最终诊断该名胎儿为EVC，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象此家系来自河南省，家系图见图1。孕妇26岁，孕4产1，宫内单胎妊娠，初诊孕周18+2周，否认近亲婚配史，否认遗传病家族史。5 a前曾于孕18周发现胎儿心内结构畸形、胸廓畸形、四肢短小，引产1男胎，未行遗传学检测；4 a前于孕24周发现胎儿心内结构异常、胸廓畸形、四肢短小畸形、双手小拇指多指，引产1男胎，孕中期行羊水染色体G显带核型分析未见异常；3 a前足月顺娩1女婴，现体健。入院前超声检测发现胎儿(先证者)股骨小于-2.7sd，肱骨小于-2.8sd，房室间隔缺损，双侧大腿软组织较同龄孕周胎儿偏厚、双手多指。本研究经本院医学伦理委员会审查通过(编号20210130CRP)。

箭头所示为先证者

1.2 产前三维系统超声检查在签署知情同意书后，对胎儿进行产前三维系统超声评估。采用GEVoluson E8/E10彩色多普勒超声仪，凸阵探头频率3.0～5.0 MHz。获取胎儿的正中矢状切面、鼻唇冠状切面、侧脑室切面、横切面、顶臀上切面等，仔细观察胎儿心脏、脑等部位并测量头围(head circumference，HC)、双顶径(biparietal diameter，BPD)、腹围(abdomen circumference，AC)、股骨长(femur length，FL)、胫骨长(tibia length，TIB)、腓骨长(fibula length，FIB)、肱骨长(humerus length，HL)、桡骨长(radial length，RAD)、尺骨长(ulna length，Ulna)、小脑横径(cerebellar diameter，Cereb)等胎儿生物学指标。

1.3 羊水染色体G显带核型分析采用羊膜腔穿刺术抽取25 mL羊水，进行染色体G显带核型分析。常规培养羊水细胞，制备分离中期的染色体分裂象，依据《人类细胞遗传学国际命名体制2013版》标准[5]进行G显带核型分析。

1.4 微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization,aCGH)分析用DNA提取试剂盒(北京天根公司，DP-318)提取羊水、孕妇及配偶外周血DNA，测定DNA浓度和纯度。取400 ng DNA，应用SurePrint G3人CGH Microarray试剂盒(美国Agilent公司)进行检测，主要步骤包括酶切、Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记、纯化、杂交、洗片等。用SureScan Microarray Scanner扫描系统对探针信号进行扫描，用Agilent CytoGenomics 2.9软件分析扫描结果。检测结果与OMIM、DGV、PubMed等数据库进行比对，参考已知综合征、文献报道、拷贝数变异包含基因等判断拷贝数变异性质。

1.5 高通量测序检测取羊水样本，采用安捷伦遗传疾病捕获探针(Agilent Technologies公司)试剂盒检测2 742个已知疾病相关基因；使用Hiseq X Ten(Illumina公司)平台完成高通量测序。原始测序数据与hg19比对定位，由NextGENe软件分析生成BAM和VCF文件；利用Ingenuity Variant Analysis进行变异注释。

1.6 Sanger测序验证采集羊水样本、胎儿父母及其健康女儿的外周血，根据高通量测序结果获得的2个可疑位点，进行Sanger测序验证。扩增引物通过Premier 5.0软件设计，剪切位点上游引物序列为5’-AGACCTTGCTATTTGTTCAT-3’，下游引物序列为5’-TCCACATTCTTCTTTCCATA-3’；缺失移码杂合变异位点上游引物序列为5’-ATTCACCACCT TCCAAACCA-3’，下游引物序列为5’-TGGCAGAGCGAGACTCAAAT-3’。进行常规PCR反应。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR产物经纯化后行一代基因测序，采用NCBI BLAST在线软件进行序列分析，与GenBank中的正常序列进行比对。将检测结果与OMIM、DGV、DECIPHER等数据库进行比对，判断拷贝数变异性质；参考美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南判断变异的性质[6]。

2 结果

2.1 产前三维系统超声结果孕妇月经孕周为23+3周，经测量超声孕周为20+5周。胎儿超声检查结果(图2)如下。①心脏结构异常：完全型心内膜垫缺损。②胸廓：心胸比增大，面积比0.37，横径比0.43，肋骨短小，胸腹比减小。③肢体：臂及腿长骨均小于第1百分位数，双手轴后多指；右侧大腿软组织增厚，双侧摇椅足。胎儿BPD、HC、AC、FL、TIB、FIB、HL、RAD、Ulna、Cereb分别为5.50、72.90、205.90、187.80、30.40、26.00、21.70、31.80、24.40、26.10、24.10 mm。经分析，FL、TIB、FIB、HL、Ulna均小于第1百分位数，BPD位于第26.2百分位数，HC位于第11.5百分位数，AC位于第45.2百分位数，RAD位于第6.1百分位数，Cereb位于第32.9百分位数。

A：完全型心内膜垫缺损；B：左手轴后六指；C：双侧摇椅足；D：心胸大体观；E：心胸面积比；F:心胸横径比

2.2 羊水染色体G显带核型分析结果羊水细胞染色体核型分析未见异常(图3)。

图3 羊水染色体G显带核型分析

2.3 aCGH检测结果胎儿羊水标本、孕妇外周血、孕妇丈夫外周血未检测到400 kb以上致病性微重复/微缺失。

2.4 高通量测序和Sanger测序结果高通量测序显示胎儿EVC2基因NM_147127：c.519+1G>C剪接位点杂合变异和EVC2基因NM_147127：c.903delG(p.phe302fs)缺失移码杂合变异。Sanger测序显示胎儿母亲EVC2基因NM_147127：c.519+1G>C剪接位点杂合变异，父亲EVC2基因NM_147127：c.903delG(p.phe302fs)缺失移码杂合变异；胎儿EVC2基因的两个变异分别源自父母(图4)。

A、B、C：胎儿、胎儿母亲、健康女儿EVC2基因c.519+1G>C剪接位点杂合变异；D、E：胎儿、胎儿父亲EVC2基因c.903delG(p.phe302fs)缺失移码杂合变异；F：健康女儿EVC2基因c.903未出现变异

2.5 妊娠结局结合遗传学分析和产前超声结果，该家系确诊为EVC。根据产前系统超声和基因检测结果，经遗传咨询后孕妇选择终止妊娠。

3 讨论

EVC为一种常染色体隐性遗传的骨骼发育不良疾病，可由EVC基因或EVC2基因变异引起[7-8]。该疾病的病理基础是指甲、皮肤等外胚层组织以及软骨发育不良，导致骨骺不能正常产生柱状软骨，进而导致腔骨干骺端近端的畸形，以及手、足骨的成熟和融合的加速。患有这种疾病的人前臂、小腿、肋骨较短，胸部较窄；同时常见的临床表现有多指和多趾，指甲和脚趾甲畸形以及牙齿异常等；同时超过一半的患者患有先天性心脏病，这也是EVC患者常见的致死原因[9-11]。

EVC2基因定位于4p16.2，长度约为146 121 bp，由22个外显子和21个内含子组成，可以翻译1 308个氨基酸，结构域包括1个跨膜区、3个螺旋式卷曲区及1个Rho GEF区。有学者[12]研究发现在Weyers颅面骨发育不全的3个家系中发现1个已经报道过的EVC2基因的c.3793delC变异和2个发生在相同核苷酸位置的新发变异c.3797T-G和c.3797T-A，这2个新发变异均可导致1 266位的亮氨酸翻译截断，这3个变异都紧密聚集在EVC基因第22号外显子的3’端，是Weyers颅面骨发育不全的变异热点，可能通过影响EVC2基因的表达进而导致骨骼系统发育障碍。美国学者[13]发现EVC2基因的2个杂合剪接变异c.384+5G>C和c.1465-1G>A可能通过改变剪切方式进而影响EVC2基因的功能，从而参与EVC的发生。

本家系的临床诊断不明确且两个症状类似的多发畸形胎儿已经引产，孕妇就诊时怀孕18周，因此进行羊膜腔穿刺以明确诊断。产前三维系统超声提示胎儿宫内发育迟缓、多发畸形。羊水染色体核型分析和aCGH分析均未发现异常，高通量及Sanger测序结果提示胎儿EVC2基因NM_147127：c.519+1G>C剪接位点杂合变异和EVC2基因NM_147127：c.903delG(p.phe302fs)缺失移码杂合变异；这两个变异位点来自父母，同时查阅ClinVar数据库和HGMD数据库中未见此两个变异的报道，ExAC数据库中未见该变异在人群中携带频率的报道。依据ACMG遗传变异分类标准与指南，这两个变异可分类为“可能致病”(PVS1+PM2)，可能导致EVC。

EVC2基因NM_147127：c.519+1G>C杂合变异位于第4号外显子和第5号外显子之间内含子区域的第1个碱基，是EVC2基因pre-mRNA到mRNA成熟过程中内切酶识别的剪切位点，该变异会造成pre-mRNA异常剪切，从而影响EVC2 mRNA的表达。EVC2基因NM_147127：c.903delG变异位于EVC2基因第8号外显子区，c.903位点G的缺失会引起转录过程中开放阅读框的移码,从而在翻译过程中造成第302位苯丙氨酸之后的氨基酸序列发生改变，影响EVC2蛋白的表达和功能。这两个位点的复合杂合变异可能造成EVC2基因表达发生变化，进一步导致EVC2基因功能的改变，进而导致疾病的发生。研究[14]表明，在小鼠的成纤维细胞中敲除EVC2并不影响纤毛的形成，但会抑制由GLI 家族锌指蛋白1介导的音猬因子激活，而音猬因子是Hedgehog信号通路的靶标；敲除EVC2将阻止Hedgehog诱导的小鼠间充质细胞分化为成骨细胞，进而导致机体的骨骼系统发育障碍，从而形成EVC。

综上所述，在这个EVC家系中，检测出的EVC2基因NM_147127：c.519+1G>C剪接位点杂合变异和EVC2基因NM_147127：c.903delG(p.phe302fs)缺失移码杂合变异可能导致EVC，这一结果有助于EVC家系的产前遗传咨询和基因诊断。