益生菌摄入对低纤维饮食小鼠肠道菌群失衡的影响

郑 志，朱 瑜，姜林娟，朱绍辉，朴丙熙，侯 栋

1)新乡医学院公共卫生学院卫生毒理学教研室 河南新乡 453000 2)韩陵医药研究院有限公司 南京 211100 3)新乡医学院第一附属医院普通外科 河南卫辉 453100 4)莱帕坚(株)公司 韩国首尔 04393

肠道微生物菌群是由上千种微生物共同组成的一种复杂微生态，影响宿主健康或疾病状态[1]。在某些外界因素(如宿主的饮食结构、疾病等)影响下，肠道微生态平衡会被破坏，导致肠道微生物菌群的组成和功能异常，称为肠道菌群失调。研究[2]报道，长期以肉类为主要食物的西方饮食习惯欠缺纤维成分，会导致肠道内微生物菌群的生态发生变化，引起肠道菌群失调。近年来我国居民饮食结构有“西方化”趋势，膳食纤维的摄入水平较低，仅约5%的人群达到推荐适宜纤维摄入量，其他约一半人群只达适宜量的40%～79%[3]。肠道菌群平衡失调与人类多种慢性代谢疾病(如肥胖、糖尿病、肠炎、慢性肾脏疾病等)有关[4]。而益生菌可添加到食品、保健品、营养补充剂、药品中，能调控肠道微生态平衡[5-6]，促进人体健康。联合国粮食和农业组织(FAO)/WHO认为适当剂量益生菌对人体健康有利；它不仅能调整微生态平衡，通过多种代谢途径对人体产生有益的影响，产生多种营养物质，提高人体免疫力，还能显著改善肠道健康[7-8]。因此，本研究通过低纤维饲料小鼠模型，观察益生菌摄入对模型小鼠肠道菌群失调后肠道微生物菌群的影响，探讨其对肠健康的改善作用，旨在为低纤维膳食饮食习惯人群的益生菌膳食干预方案的拟定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料三株益生菌[枯草芽孢杆菌(KCTC13241)、鼠李糖乳杆菌(KCTC5033)和双歧杆菌(KCTC5854)]以及低纤维小鼠饲料(Crea公司，日本)由韩国莱帕坚公司赠送。枯草芽孢杆菌在30 ℃ LB培养基中培养18 h，鼠李糖乳杆菌在37 ℃ MRS培养基中培养48 h，双歧杆菌在37 ℃ MRS培养基中厌氧条件下培养48 h。取培养好的菌液，4 000 r/min，4 ℃离心10 min，去除上清液，将沉淀菌株用无菌生理盐水清洗，再用无菌生理盐水稀释为1010CFU/mL菌株样品，备用。小鼠粪便DNA试剂盒购自美国Zymo research公司，Qubit-iTTMDNA HS分析试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司。5周龄雄性昆明小鼠和耗材(普通饲料、垫料)等购自北京维通利华实验动物技术公司，饲养环境：温度(23±3) ℃，湿度(51±5)%，明暗交替周期为12 h(07:00～19:00)，单笼饲养，正常饮食。研究起止时间为2019年12月至2021年5月。

1.2 主要仪器HH.CP-T型CO2培养箱(杭州川一实验仪器有限公司)，HZQ-F160A型恒温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，5804R型高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司)，SX-300型高温高压灭菌锅(日本TOMY公司)，UV-2600型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，CX21型光学生物显微镜(日本奥林巴斯公司)，Qubit 2.0型荧光定量仪(美国赛默飞世尔科技公司)，GeneAmp9700型ABIPCR系统(美国应用生物系统公司)。

1.3 实验分组及处理小鼠进行1周适应性饲养后采用随机数字表法分为正常组、低纤维饲料组(阳性对照组)、低纤维饲料+枯草芽孢杆菌处理组(枯草芽孢杆菌组)、低纤维饲料+鼠李糖乳杆菌处理组(鼠李糖乳杆菌组)和低纤维饲料+双歧杆菌处理组(双歧杆菌组)5组(每组8只)。正常组给予普通饲料，阳性对照组及各益生菌处理组给予低纤维饲料，自由摄取。普通和低纤维饲料的营养成分见表1。正常组和阳性对照组每天灌胃1 mL的生理盐水，各益生菌处理组每天灌胃1 mL益生菌(109CFU/mL，生理盐水稀释)，持续6周。所有动物实验均在新乡医学院伦理委员会的伦理审查和监督下完成。

表1 普通饲料和低纤维饲料营养成分的组成 %

1.4 各组小鼠肠道微生物菌群的丰度和多样性检测6周以后，收集每只小鼠在5 h内排出的粪便，冷冻保存(-20 ℃)备用。取0.2 g粪便，利用小鼠粪便DNA 试剂盒提取DNA，采用Qubit-iTTMDNA HS分析试剂盒调节质量浓度为5 μg/L作为标准。16S rDNA V4区扩增引物为5’-TCGTCGGCAGCGT CAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3’(上游引物序列)，5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’(下游引物序列)，进行PCR扩增。各样品的扩增产物依托韩国喜灵生物科技有限公司使用Illumina Miseq进行高通量测序，通过MOTHUR[9]程序对得到的原始数据进行质量过滤及双端序列的连接、质控。将所得序列以98%的一致性进行操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类和注释。基于OUT聚类结果，对样品进行菌群丰度(Chao指数)和多样性(Shannon指数)分析。采用线性判别分析法(linear discriminant analysis，LDA；筛选标准：LDA得分>3[10])确定益生菌组与阳性对照组差异有统计学意义的特异性菌群(P<0.05)。采用多样性分析的非度量多维尺度分析法(non-metric multidimensional scaling，NMDS)评估各组微生物群落构成的相似性。

1.5 统计学处理对各样品OUT聚集结果进行Spearman秩相关分析，构建菌属相关关系的共丰度基因集合(co-abundance gene group，CAG)网络图，获得菌属之间相互作用信息。采用PICRUSt2预测益生菌代谢通路信息，利用ALDEx 2(R软件包，4.1版本)进行统计分析，与KEGG数据库比较并注释相应功能，获得益生菌在缺乏纤维肠道菌群的代谢通路的预测信息。采用SPSS 25.0处理数据，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较5组的Chao和Shannon指数的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠肠道菌群的丰度和多样性检测结果见表2。由表2可知，阳性对照组和经长达6周干预后的各益生菌处理组Chao指数均低于正常组(P<0.05)，即阳性对照组和各益生菌处理组的小鼠肠道菌群丰度降低。其反映菌群多样性的Shannon指数在各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，即各组间的菌群种类多样性无差异。

表2 各组肠道菌群的丰度和多样性检测结果(n=8)

2.2 各组小鼠肠道菌群组成见图1。门(Phylum)水平丰度聚类热图显示各组小鼠肠道菌群均以拟杆菌门(Firmicutes)和厚壁菌门(Bacteroidetes)丰度较高(图1A)；与正常组相比，阳性对照组和益生菌处理组拟杆菌门和厚壁菌门丰度表现有差异。由图1B可知，益生菌处理组小鼠肠道拟杆菌门丰度降低，如在属水平下各样本中拟杆菌门的主要菌属[如普雷沃菌属(Porphyromonadaceaefamily，Prevotella)]在阳性对照组和益生菌处理组丰度最低，在正常组最多；但厚壁菌门主要菌属[如拟杆菌属菌群(Bacteroides)]在益生菌处理组丰度最高，在正常组最少。阳性对照组和益生菌处理组小鼠厚壁菌门的菌属Ruminococcaceaefamily，Erysipelortichaceaefamily，Clostridialeorder丰度与正常组小鼠相比均增高。

A:门水平丰度；B：属水平丰度

2.3 各组小鼠肠道菌群的LDA和NMDS分析结果见图2。由图2可知，与阳性对照组相比，各益生菌处理组小鼠肠道相对丰度特异性增高的菌群为梭菌目(Clostridialesorder)(如枯草芽孢杆菌和双歧杆菌组的OTU0063、鼠李糖乳杆菌组OTU0026和OTU0096)(P<0.05)；由图2B、C可知，鼠李糖乳杆菌组和双歧杆菌组小鼠肠道中链球菌属(OTU0100Steptococcus)相对丰度增高，双歧杆菌组小鼠肠道的瘤胃球菌科家族(OTU0007Ruminococcaceaefamily)和韦荣球菌科(OTU0002Erysipelotrichaceaefamily)相对丰度也增高。由图2D可知，与正常组相比，阳性对照组和益生菌处理组的菌属构成差异有统计学意义(P<0.05)，而阳性对照组和益生菌处理组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组小鼠肠道菌群的LDA(A、B、C)和NMDS(D)分析结果

2.3 各组小鼠肠道菌属相关性分析见图3。

A：枯草芽孢杆菌组；B：鼠李糖乳杆菌组；C：双歧杆菌组；D：阳性对照组。OTU之间的红线代表相互之间呈负相关关系(r<-0.75)，蓝色代表相互之间呈正相关关系(r>0.75)

2.4 各组小鼠肠道菌属KEGG代谢通路差异分析见表3。由表3可知，食用3株益生菌处理后，在低纤维饲料小鼠肠道中发现参与短链脂肪酸的17条代谢通路(包括丁酸和丙酸等短链脂肪酸)，其中与枯草芽孢杆菌膳食相关的有4条、与鼠李糖乳杆菌膳食相关的有4条、与双歧杆菌膳食相关的有14条。食用双歧杆菌的代谢通路与食用鼠李糖乳杆菌的代谢通路基本相似，但与枯草芽孢杆菌的代谢通路不同。

3 讨论

3.1 低纤维饮食造成肠道微生物菌群失衡合理搭配膳食结构能促进肠道中优势菌的生成，提高微生物生成酶活性，增强机体免疫功能，促进人体健康。而不合理膳食，如低纤维饮食对肠道菌群组成、结构和功能产生影响，引起肠道菌群失调。人类及哺乳动物的肠道优势菌种为厚壁菌门和拟杆菌门，约占肠道总微生物菌的50%～80%和10%～30%。此外，还有1%～20%的变形杆菌门和3%～15%的其他菌门。有研究[11]表明，高脂食物诱导导致肠道中发挥免疫功能的乳酸杆菌、变形菌门的丰度显著增加，而拟杆菌门的丰度显著减少，认为厚壁菌门对拟杆菌门的比例增大可能与体重增加、发育受损、肝脏组织及功能异常、肠道菌群多样性降低有关。本研究发现，各组小鼠肠道菌群均以拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌(图1)，与正常组相比，低纤维膳食小鼠肠道微生物的丰度降低。本研究还发现在肠道菌属水平上，乳酸杆菌处理后低纤维膳食小鼠肠道中Ruminococcaceaefamily、Erysipelortichaceaefamily、Clostridialesorder等厚壁菌门的丰度有所升高，而具有分解纤维功效的拟杆菌门的丰度反而降低，从而导致厚壁菌门/拟杆菌门的比例增加，该结果与杨佳等[12]的高脂饮食可引起肠道微生态多样性的下降以及厚壁菌门/拟杆菌门比例升高的结果一致，说明低纤维饮食习惯会抑制肠道优异菌的生长及活性，造成肠道内厚壁菌门/拟杆菌门的比例升高。

3.2 益生菌对低纤维饮食造成的肠道菌群失调的影响本研究结果发现，益生菌处理组小鼠肠道微生物丰度与阳性对照组小鼠相比差异无统计学意义，但仍低于正常组小鼠，推断低纤维饮食习惯造成肠道中微生物生长时必不可少条件的严重匮乏，从而限制肠道菌群和膳食中益生菌的生长及其活性发挥。此外，各组肠道菌属相关性分析(图3)结果显示，低纤维饮食的肠道环境经益生菌处理可能会导致体内菌群间出现不同正或负相关，认为不同菌株益生菌处理可能导致肠道微生物间相关关系显示不同。

普雷沃菌属具有食用碳水化合物和纤维分解功效，可作为饮食生物标志物[13]。Ortega-Santos等[14]报道，采用高纤维饮食进行的减重机制与肠道内普雷沃菌属丰度提高相关。本研究发现给予低纤维饲料喂食的小鼠肠道内检测不到普雷沃菌属，说明这与低纤维饮食造成肠道内必要的营养缺乏有关，导致微生物和益生菌生长及活性发挥被限制。益生菌在肠道中的生长和活性还取决于肠道pH值，如碳水化合物食物饮食可降低肠腔的pH值，从而影响肠道菌群代谢和微生物竞争。其次，含丰富纤维食物摄入能促进肠道微生物在肠道中的转移和定植，但高脂/低纤维饮食不具有相应功效，造成肠道微生物区域异质性[15]，从而限制益生菌生长和活性发挥。

3.3 益生菌对低纤维饮食导致的短链脂肪酸代谢通路的影响短链脂肪酸是肠道微生物群和宿主之间信号分子的产物，是饮食和肠道环境中肠道微生物群之间复杂相互作用而形成的。高脂饮食习惯可降低肠道菌群丁酰辅酶A和乙酸辅酶A转移酶的相对丰度[16]，降低与普雷沃菌属相关甲基丙二酰辅酶A脱羧酶α亚基基因的相对丰度，从而降低短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸等产量[17]。双歧杆菌能提高肠道丁酰辅酶A和乙酸辅酶A转移酶的相对丰度，从而促进丁酸盐产量，这与本研究KEGG结果一致(表3)。此外，乳酸脱氢酶是参与糖酵解最后一步的重要酶，催化丙酮酸逆转化为乳酸，发挥其在癌症疾病预测、诊断和预后中的应用[18]。本研究的枯草芽孢杆菌不涉及乳酸脱氢酶代谢途径(表3)。Mazkour等[19]报道，枯草芽孢杆菌促进与乳酸生成相关的有益菌增加，抑制大肠杆菌等有害菌，促进乳酸产生，但不直接参与乳酸盐代谢，本研究结果与其一致。本研究还发现益生菌摄入可部分改变低纤维饮食造成的肠道菌群失衡如微生物丰度及菌属相关性，推测该改变与益生菌的菌属特性有关，其代谢通路也不相同。

本研究未能探讨正常或高纤维膳食情况下益生菌对低纤维饮食导致的肠道菌群失调的改善，但益生菌摄入对低纤维摄取导致的肠道菌群失调的改善效果未能达到有效水平，推断低纤维食物是造成益生菌“失活”的决定性因素。Hjorth等[20]的高纤维饮食减重研究表明，与肥胖中低比例的普雷沃菌属/拟杆菌属个体相比，高比例个体体重和体脂的减少效果更显著，这也能证实维持和促进有益菌(如普雷沃菌属等)生长的微生物环境与食物模式也许极为重要。

综上，本研究的3株益生菌(枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌)对肠道健康具有有效的保护和改善作用，但如果益生菌产品消费者缺乏高纤维膳食习惯，可能导致其改善效果不会太理想。因此，本研究认为通过益生菌膳食改善肠道菌群的方案既需考虑益生菌的菌属特性，还应结合充分的高纤维摄取饮食习惯的培养。