LncRNA DSCAM-AS1在寻常型银屑病皮损组织中的表达及其对IL-22诱导的角质形成细胞增殖和凋亡的影响

李旭阳，郑云鹏，金芳草，尹光文

郑州大学第一附属医院皮肤科 郑州 450052

寻常型银屑病是一种免疫相关性慢性炎症性皮肤病，其发生发展与角质形成细胞的增殖分化密切相关，抑制角质形成细胞过度增殖对银屑病的治疗尤为重要[1]。长链非编码RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA，LncRNA如MIR31H、MSX2P1可靶向miRNA调控靶基因的表达，进而发挥生物学功能，与银屑病的发病机制密切相关[2-5]。唐氏综合征细胞黏附分子反义RNA 1(Down syndrome cell adhesion molecule-AS1，DSCAM-AS1)是一种LncRNA，位于染色体21q22.2。有报道[6]称，DSCAM-AS1在黑色素瘤组织和细胞系中表达升高，且高表达患者预后生存时间缩短，敲低其表达可降低黑色素瘤细胞的恶性行为，可作为黑色素瘤的预后生物标志物及治疗靶标。研究[7]显示，寻常型银屑病患者皮损组织中miR-199b-3p的表达明显低于正常人皮肤组织。炎性细胞因子如IL-22、IL-6和肿瘤坏死因子α可激活角质形成细胞，使其过度增殖及分化，诱发寻常型银屑病的发生发展[8]。Starbase生物信息学软件预测显示，DSCAM-AS1可能靶向结合miR-199b-3p。因此，本研究采用IL-22刺激角质形成细胞HaCaT建立体外寻常型银屑病细胞模型，观察DSCAM-AS1/miR-199b-3p对模型细胞增殖和凋亡的影响，以期为寻常型银屑病的治疗提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料选取2018年2月至2019年12月于郑州大学第一附属医院皮肤科就诊的37例寻常型银屑病患者，男14例，女23例，年龄6～57(46.3±9.2)岁。排除标准：合并红斑狼疮、皮肌炎、天疱疮等自身免疫性皮肤病的患者；严重感染及其他疾病患者。另选同期于整形外科行整形手术者37例为正常对照，男11例，女26例，年龄5～62(45.3±8.2)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义，具有可比性。寻常型银屑病患者皮损组织及正常对照皮肤组织均取自腿部，约100 mg。将获得的组织样本用磷酸盐缓冲液清洗后，沿组织边缘加入1.5 mL 2.5 g/L胰蛋白酶消化24 h，分离表皮，用于检测DSCAM-AS1与miR-199b-3p的表达。本研究经本院医学伦理委员会批准，符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》的要求，所有受试者均签署知情同意书。

角质形成细胞HaCaT购自上海研域生物技术有限公司。高糖DMEM培养基、细胞计数试剂盒CCK-8、BCA蛋白检测试剂盒及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司，双荧光素酶活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒和PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,DSCAM-AS1小干扰RNA(si-DSCAM-AS1)、乱序无义阴性序列(si-NC)、miR-199b-3p 模拟物和抑制剂(anti-miR-199b-3p)、模拟物阴性对照序列(miR-NC)、抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)及引物序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司，CyclinD1、Bcl-2、Bax、IL-6受体(IL-6R)及信号转导与转录激活因子3(STAT3)抗体购自美国Santa Cruz公司，RNA纯化试剂盒购自天津市莱博科技有限公司。

1.2 银屑病皮损组织及正常表皮组织中DSCAM-AS1和miR-199b-3p表达的检测采用qRT-PCR法。RNA抽提试剂盒提取银屑病皮损组织及正常皮肤表皮组织总RNA，反转录后行PCR扩增。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列：DSCAM-AS1上游5’-GTGACACAGCAAGACTCCCT-3’ ，下游5’-GATCCGTCGTCCATCTCTGT-3’ ；miR-199b-3p上游5’-GTCACAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游5’-TC CGACGCCGCCATCTCTA-3’ ，下游5’-TATCGCACATTAAGCCTCTA-3’；β-actin上游5’-GGCCCAGAAT GCAGTTCGCCTT-3’ ，下游5’-AATGGCACCCTGCT CACGCA-3’。PCR反应体系：PCR预混液12.5 μL,上、下游引物各0.75 μL，cDNA模板2 μL，双蒸水9 μL。扩增程序：95 ℃10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算DSCAM-AS1相对于β-actin、miR-199b-3p相对于U6的表达水平。

1.3 细胞培养和分组将HaCaT细胞在超净工作台内复苏，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2、97%湿度的培养箱中培养。取对数生长期的HaCaT细胞，采用LipofectamineTM2000脂质体转染法，分别转染si-DSCAM-AS1、miR-199b-3p模拟物或共转染si-DSCAM-AS1与anti-miR-199b-3p；转染6 h后，均用含100 μg/L IL-22的培养基刺激24 h，分别记为IL-22+si-DSCAM-AS1组、IL-22+miR-199b-3p组、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组。分别以转染si-NC、miR-NC或共转染si-DSCAM-AS1与anti-miR-NC 6 h后，IL-22刺激24 h的细胞为对照，记为IL-22+si-NC组、IL-22+miR-NC组、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组。同时设常规培养基培养的细胞(NC组 )和用含100 μg/L IL-22的培养基处理24 h的细胞 (IL-22组)为对照。

1.4 细胞增殖检测取HaCaT细胞接种于96孔板(1.0×104个/孔)，培养12 h后，弃培养基，按1.3分组处理24 h。然后每孔加10 μL CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪450 nm处测定吸光度(A)值，代表细胞增殖能力。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测取HaCaT细胞接种于12孔板(5.0×104个/孔)，培养12 h后，弃培养基，按1.3分组处理24 h。收集细胞，用PBS清洗2次。取各组细胞悬液(约含1.0×106个细胞)，1 500 r/min离心5 min后，加500 μL结合缓冲液，混悬细胞。再依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.6 细胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2、IL-6R和STAT3蛋白表达的检测采用Western blot法。取HaCaT细胞接种于6孔板(2.5×105个/孔)，培养12 h后，弃培养基，按1.3分组处理24 h。收集细胞，用PBS清洗2次。然后用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，经BCA法测蛋白浓度、SDS-PAGE电泳、转膜及50 g/L脱脂奶粉溶液封闭后，加一抗(CyclinD1、Bax、Bcl-2按1∶500稀释，IL-6R、STAT3和β-actin按1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。加山羊抗兔二抗(1∶2 000稀释)，37 ℃孵育1 h。滴加化学发光试剂，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对于β-actin的表达水平。实验重复3次。

1.7 双荧光素酶报告实验取HaCaT细胞接种于6孔板(5.0×105个/孔)，利用LipofectamineTM2000脂质体转染法，分别共转染野生型(WT)DSCAM-AS1与miR-199b-3p模拟物或miR-NC，突变型(MUT)DSCAM-AS1与miR-199b-3p模拟物或miR-NC(上海生工生物工程股份有限公司)。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞并裂解。3 500 r/min离心5 min后，取上清，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.8 统计学处理应用SPSS 22.0处理数据。采用两独立样本t检验比较正常皮肤组织和银屑病皮损组织以及NC组和IL-22组细胞DSCAM-AS1和miR-199b-3p表达水平的差异；采用单因素方差分析比较NC组、IL-22组、IL-22+si-NC和IL-22+si-DSCAM-AS1组细胞增殖能力，凋亡率，DSCAM-AS1、CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平，两两比较用LSD-t检验；采用两独立样本t检验比较IL-22+miR-NC组和IL-22+miR-199b-3p组以及IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组和IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组细胞增殖能力，凋亡率，miR-199b-3p及CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 银屑病皮损组织中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表达与正常皮肤组织比较，银屑病皮损组织中DSCAM-AS1表达增高，miR-199b-3p表达降低。见表1。

表1 银屑病皮损组织中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表达

2.2 IL-22刺激的HaCaT细胞中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表达与NC组比较，IL-22组HaCaT细胞中DSCAM-AS1表达增高，miR-199b-3p表达降低。见表2。

表2 IL-22刺激的HaCaT细胞中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表达

2.3 敲减DSCAM-AS1对IL-22刺激的HaCaT细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响与NC组比较，IL-22组HaCaT细胞DSCAM-AS1表达增强，A值升高，凋亡率降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达减少；与IL-22+si-NC组比较，IL-22+si-DSCAM-AS1组DSCAM-AS1表达减弱，HaCaT细胞A值降低，凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加；而IL-22组与IL-22+si-NC组各检测指标比较差异无统计学意义。见图1、表3。

1～4：分别为NC组、IL-22组、IL-22+si-NC组、IL-22+si-DSCAM-AS1组

表3 敲减DSCAM-AS1对IL-22刺激的HaCaT细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.4 双荧光素酶报告实验结果Starbase生物信息学软件预测显示，DSCAM-AS1与miR-199b-3p的核苷酸序列存在连续结合位点，见图2。双荧光素酶报告实验结果(表4)提示DSCAM-AS1可靶向结合miR-199b-3p。

图2 miR-199b-3p和DSCAM-AS1的结合位点

表4 双荧光素酶报告实验结果

2.5 过表达miR-199b-3p对IL-22刺激的HaCaT细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响与IL-22+miR-NC组比较，IL-22+miR-199b-3p组HaCaT细胞miR-199b-3p的表达升高，A值降低，凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加。见图3、表5。

1、2：分别为IL-22+miR-NC组和IL-22+miR-199b-3p组

表5 过表达miR-199b-3p对IL-22刺激的HaCaT细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.6 敲减miR-199b-3p对IL-22刺激下敲减DSCAM-AS1的HaCaT细胞增殖和凋亡的影响与IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组比较，IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组HaCaT细胞中miR-199b-3p表达降低，A值升高，凋亡率降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达减少。见图4、表6。

1、2：分别为IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组和IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组

表6 敲减miR-199b-3p对IL-22刺激下敲减DSCAM-AS1的HaCaT细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.7 各组细胞IL-6R/STAT3信号通路蛋白的表达与NC组比较，IL-22组HaCaT细胞中IL-6R和STAT3蛋白表达增加；与IL-22+si-NC组比较，IL-22+si-DSCAM-AS1组HaCaT细胞中IL-6R和STAT3蛋白表达减少；与IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组比较，IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组HaCaT细胞中IL-6R和STAT3蛋白表达增加。见图5、表7。

1～6:分别为NC组、IL-22组、IL-22+si-NC组、IL-22+si-DSCAM-AS1组、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC组、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p组

表7 各组细胞IL-6R、STAT3蛋白的表达情况

3 讨论

DSCAM-AS1作为一种LncRNA，目前对其研究多集中于肿瘤方面。研究[9-11]显示，DSCAM-AS1在结肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤中表达升高，起促癌基因作用，敲低其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

本研究结果显示，DSCAM-AS1在寻常型银屑病皮损组织及IL-22刺激的角质形成细胞HaCaT中表达增加，敲减DSCAM-AS1抑制了IL-22刺激的角质形成细胞增殖，并加剧细胞凋亡，推测DSCAM-AS1可作为潜在的寻常型银屑病的分子治疗靶点。细胞增殖和凋亡受多种基因分子的调控，其中CyclinD1是细胞周期调控分子，其表达增加可促进细胞周期由G1期向S期转变，加速细胞增殖[12]。Bax/Bcl-2参与调控细胞凋亡，Bax发挥促凋亡作用，而Bcl-2是抗凋亡分子，其表达增加时与Bax形成异源二聚体，减弱Bax的促凋亡作用[13]。本研究结果显示，敲减DSCAM-AS1降低了IL-22刺激的角质形成细胞中CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达，促进了Bax蛋白的表达，提示敲减DSCAM-AS1抑制IL-22刺激的角质形成细胞增殖并促进细胞凋亡与其参与调控CyclinD1、Bax/Bcl-2等增殖和凋亡相关蛋白的表达有关。

为了进一步探究DSCAM-AS1影响IL-22刺激的角质形成细胞增殖和凋亡的分子机制，本研究首先通过双荧光素酶报告实验证实了DSCAM-AS1可靶向结合并负调控miR-199b-3p，这也与本研究中寻常型银屑病皮损组织及IL-22刺激的角质形成细胞中DSCAM-AS1表达增加而miR-199b-3p表达减少的结果一致。miR-199b-3p参与多种疾病的发展进程，例如其在大脑中动脉闭塞-再灌注小鼠脑组织中表达缺失，上调miR-199b-3p可通过阻断MAPK/ERK/EGR1轴增强脑微血管内皮细胞活力，并抑制其凋亡，减轻小鼠脑组织损伤[14]。本研究结果显示，过表达miR-199b-3p可抑制IL-22刺激的角质形成细胞增殖并加剧细胞凋亡，敲减miR-199b-3p可逆转敲减DSCAM-AS1对IL-22刺激的角质形成细胞增殖的抑制作用及凋亡促进作用，提示DSCAM-AS1可能通过靶向抑制miR-199b-3p来促进寻常型银屑病的发展，上调miR-199b-3p有可能起到治疗银屑病的目的。

寻常型银屑病的病理机制尚未明确，其发生发展与病灶内异常浸润的T淋巴细胞及其所产生的炎症因子有关[15]。IL-6在银屑病发生后表达升高，可与其受体IL-6R结合生成异源二聚体，并结合至gpl30上，形成高亲和力复合物IL-6/IL-6R/gpl30作用于IL-6R/JAK/STAT3信号通路，加重银屑病病情[16]。有报道[17]称，寻常型银屑病血热证患者外周血白细胞中IL-6R和STAT3蛋白表达明显升高，IL-6R/STAT3参与银屑病的发展进程；IL-6抑制剂可通过抑制IL-6R/JAK/STAT3信号传导通路有效降低银屑病大鼠背部皮肤组织角质增殖及炎症反应[18]。本研究结果显示，角质形成细胞经IL-22刺激后，IL-6R和STAT3蛋白表达增加，说明IL-22刺激激活了角质形成细胞中IL-6R/STAT3通路；而敲减DSCAM-AS1后IL-6R和STAT3蛋白表达降低，说明敲减DSCAM-AS1可抑制IL-6R/STAT3通路的激活；同时，敲减miR-199b-3p逆转了敲减DSCAM-AS1对IL-22刺激的角质形成细胞中IL-6R/STAT3通路的抑制作用，进一步提示DSCAM-AS1通过靶向抑制miR-199b-3p并激活IL-6R/STAT3通路，促进寻常型银屑病的进程。

综上，DSCAM-AS1在寻常型银屑病皮损组织及IL-22刺激的角质形成细胞中表达增加，敲减其表达可抑制IL-22刺激的角质形成细胞增殖，并促进细胞凋亡，其机制与靶向miR-199b-3p并阻断IL-6R/STAT3信号通路有关，DSCAM-AS1/miR-199b-3p轴可能为寻常型银屑病的治疗提供了新的分子靶点。