茶叶微生物研究现状与展望

黄友谊，方欣，隋梦圆，江广贤，肖婧仪，王文凤，宁瑶瑶

华中农业大学园艺林学学院，武汉430070

茶是世界上最受欢迎和消费最广泛的饮料之一，而微生物与茶联系紧密，最为典型的有微生物发酵的黑茶［1］、红茶菌［2］等。随现代科学技术的发展，微生物在茶领域的研究与应用逐渐拓宽且深入，涉及茶树种植、茶叶加工和茶叶贮存等环节，呈现多元化发展趋势，并在推动茶产业发展中发挥了明显的作用［3］。为更好地将微生物应用于茶领域，本文介绍了茶园微生物中茶树根际微生物、茶树病原微生物、茶树内生菌、茶树益肥微生物和茶园抗逆微生物的研究现状，总结了以黑茶为主的茶叶加工微生物以及茶叶卫生相关微生物的研究情况，以期促进茶叶微生物学科的形成与发展。

1 茶园微生物

1.1 茶树根际微生物

微生物生态是表征土壤质量的重要指标之一［4］。研究表明植物树龄、季节、土壤特性、间作等因素均会对根际微生物的种类和数量产生影响［5-8］。茶树根际土壤微生物群落中，以细菌含量最多，其次为真菌；由于茶树根际土壤pH 值较小，不利于放线菌的生长繁殖，因此放线菌丰度较低；细菌主要优势菌属包括假单胞菌属（Pseudomonas）、微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等，真菌优势菌属包括木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）等［9］。茶园中有益微生物常见的功能包括固氮、耐酸铝、病原菌拮抗以及促进多种营养元素（氮、磷、钾、铁等）的活化和吸收等功能［10-11］。除此之外，部分微生物还可以通过合成吲哚-3-乙酸、脱落酸、乙烯抑制剂等生长调节剂，直接影响植物生长情况［12］。在根际和叶际之间发生的植物病害较为常见，而根际、叶际等部位的微生物可以与植物共同抑制病害的发生或降低伤害，微生物可以作为植物病害防治的新途径和资源，以此达到控制病害的目的［13-14］。

1.2 茶树病原微生物与生防菌

因环境条件变化和病菌的抗药性等问题，茶树病害对茶叶生产的影响日益突出。根据病害对茶树危害部位的不同，将病害分为叶病、茎病、根病等，其中叶病是茶树中主要的病害类型。较常见的病害中，危害叶片的有茶饼病、茶炭疽病、茶轮斑病、茶云纹叶枯病、茶白星病等［15］；危害枝梢的病害有茶枝黑点病、茶红锈藻病、茶胴枯病、茶褐斑病、茶苗茎枯病等；危害根部的病害有茶紫纹羽病、茶白绢病、茶根朽病等［16-17］。也有根据茶树病原物的分类地位来划分茶树病害种类，病原物主要有真菌、细菌、病毒、线虫等［16-17］；其中真菌引起的病害被确认为是最常见的茶树病害类型，如由担子菌引起的茶饼病、茶网饼病、茶炭疽病以及茶云纹叶枯病等。与此同时，利用生防菌防治病虫害是生物防治的重要手段，各种类型的微生物（病毒、细菌、真菌、线虫和微孢子等）杀虫剂被广泛地应用于农业生产中。其中在茶树方面应用比较广泛的是苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis），其主要被用于防御和治疗茶梢蛾、茶小卷叶蛾、茶尺蠖和茶细蛾等的危害。除此之外，用于防治茶尺蠖的有茶尺蠖病毒水剂，是由茶尺蠖核型多角体病毒制成。胡淑霞［18］在茶园中分离到能有效抑制茶赤叶斑病、茶白星病、茶煤病、茶轮斑病和茶褐色叶斑病的病原微生物——茶孢杆菌，为微生物防治茶园病害提供了有效途径。

1.3 茶树内生菌

植物内生菌（endophytes）包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌，许多学者对茶树内生菌的分离方法［19-21］、分布规律［22］、优势菌种鉴定［23］和生物学作用［24-25］等方面进行了研究和探讨。茶树内生细菌主要包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），内生真菌主要包括子囊菌门、担子菌门和毛霉门微生物。茶树内生真菌和细菌的数量和种类随地理环境、季节、茶树品种、组织类型、叶龄的变化而变化。近几年人们对茶树内生菌的功能研究较多，按内生菌对植物的作用效果可分为有益、有害和中性三类；其中有益菌可以分泌一些促生物质如吲哚乙酸等促进植物生长，产生生物活性物质，形成茶叶风味，提高茶树抗逆能力，防治植物病害等；有害菌能够引起植物病害，抑制植物生长等。

1.4 茶树益肥微生物

近年来，随着绿色、生态、安全的理念逐步成为发展主流，绿色有机茶园不断建立，多种适宜绿色有机茶园应用的微生物肥料也相继出现。根瘤菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌以及各种功能性的有益微生物作为生物肥料施用于绿色有机茶园，在保证茶园绿色生态的基础上达到提升品质和增加产量的效果［26］。如张汉鹄等［27］将从茶树上分离的1 株芽孢杆菌制成微生物制剂，能够促进茶树生长发育，提高茶叶产量。此外，一种以光合细菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌为主的EM 有机肥，是由80 余种微生物复合培养而成的一类特殊的微生物制剂［28］，具有解磷、解钾、固氮等提高土壤肥力的作用。

1.5 茶园抗逆微生物

在茶园抗逆微生物的研究中，章顺成等［29］从茶树根系分离鉴定出1株耐Al3+菌株，该菌株在一定范围内对Al3+具有吸附作用；同时该菌株能反射性地主动摄入更多的水，形成较大物理静水压，以对抗由于Al3+升高而产生的高化学渗透压，从而规避铝毒害。赵希俊［30］从茶树中分离得到53 株具备耐铝功能的内生细菌，从中鉴定出Enterobacter sacchari、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）和Burkholderia seminalia的铝耐受性显著高于其他菌株；其中洋葱伯克霍尔德菌能够明显降低茶园土壤中Al3+的含量，增强了茶树的铝耐受性，还具备固氮、解磷等功能，对植物生长具有一定的促进作用。

2 茶叶加工微生物

2.1 黑茶微生物

黑茶因多种健康功效而越来越受到关注［31-32］，微生物发酵被认为是黑茶感官品质和健康功效形成的关键因素，有多种与黑茶质量相关的化学成分在多种功能核心微生物作用下发生降解、氧化、缩合、结构修饰、甲基化和糖苷化等一系列反应［1］。为了揭示黑茶中化学成分的微生物生物转化，学者们对发酵过程中微生物的群落结构和动态变化进行了大量的研究。早期对黑茶中微生物群落的研究主要依靠传统的平板分离、纯化等可培养的方法，但传统方法不能全面揭示发酵过程中微生物的群落组成。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）［33-34］、高通量测序［35-37］等免培养技术开始被广泛应用于黑茶微生物研究。

1）普洱茶（熟茶）。普洱茶（熟茶）是黑茶中微生物群落结构和动态变化方面研究最多的。研究者通过PCR-DGGE［33-34］、454 pyrosequencing 高通量测序［38］、鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）［39］、Illumina MiSeq 高通量测序［35-37］、Illumina MiSeq 高通量测序结合qPCR（quantitative PCR）技术［40］分析普洱茶微生物的群落结构和动态变化。已确定发酵过程中的主要菌属如表1所示。

表1 黑茶加工过程中的主要优势菌属Table 1 Dominant microorganisms in black tea processing

在普洱茶（熟茶）渥堆发酵过程中，细菌和真菌协同作用形成普洱茶（熟茶）独特的品质特征及健康功效，但研究者对发酵过程中的微生物结构或起主导作用的微生物群体尚未达成共识。Zhao等［38］研究表明普洱茶（熟茶）发酵过程中曲霉属是唯一的优势真菌，占全部测定序列的94.98%；最优势的细菌门为变形菌门（48.42%），主要包括假单胞菌属（17.82%）、unclassified_Enterobacteriaceae（7.69%）、无色杆菌属（4.74%）等；其次为厚壁菌门（19.91%）、放线菌门（Actinobacteria，16.91%）、蓝菌门（Cyanobacteria，9.95%）和拟杆菌门（3.79%）。也有研究表明在普洱茶（熟茶）发酵前期虽然以曲霉属占据绝对优势，但随着发酵进行，曲霉属相对丰度显著下降，后期逐渐演替为芽生葡萄孢酵母属占据优势地位［35］；发酵前期以欧文氏菌属、泛菌属和假单胞菌属为主，而发酵中、后期芽胞杆菌属、葡萄球菌属、短杆菌属、考克氏菌属及短状杆菌属为优势菌群［36］。Ⅼi等［40］研究表明普洱茶（熟茶）发酵过程中，尽管枝孢霉属（Cladosporium）和附球菌属（Epicoccum）在原料中超过所有测定序列的80%，但随着发酵进行，曲霉属很快成为优势菌属，主导着整个发酵过程；发酵后期黑曲霉（Aspergillus niger）的丰度显著下降，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）、埃默森蓝状菌（Rasamsonia emersonii）和疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）相对丰度增加，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母成为发酵中的优势菌种，其次为埃默森蓝状菌、疏绵状嗜热丝孢菌和帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）；在属水平上，norank_o_Chloroplast是原料中的绝对优势细菌，加工过程中norank_o_Chloroplast急剧下降，泛菌属在发酵中期的丰度增加到56.68%，芽孢杆菌属在发酵后期显著增加至82.97%，成为绝对优势细菌。Ⅼi等［39］同样发现在普洱茶发酵前期，属水平上优势微生物是曲霉属（42.10%），其次为假单胞菌属（19.40%）和德巴利酵母属（4.78%），且黑曲霉为优势菌种，相对丰度为12.88%；在发酵后期，曲霉属相对丰度大幅度下降至6.51%，其他菌属包括无色杆菌属（8.39%）、Sugiyamaella（6.55%）、Rasamsonia（6.43%）、德巴利酵母属（6.24%）和横梗霉属（5.91%）成为优势菌属，同时Sugiyamaella lignohabitans（6.55%）和埃默森蓝状菌（6.43%）成为后期的优势菌种。

已有的研究表明普洱茶（熟茶）发酵过程中微生物组成、结构和多样性的变化显著，不同研究中报道的微生物群落结构及变化的不同可能与原料来源、生产环境和发酵工艺等因素相关。但现有研究中曲霉属均被认为是普洱茶（熟茶）中重要的优势真菌，此外，真菌均在发酵中集中呈现，多样性在原料中最高，发酵过程中多样性明显降低；相对于真菌，细菌的多样性较高，发酵前后细菌的多样性和丰富度均显著增加。

2）茯砖茶。茯砖茶微生物发酵可以划分为用于生产黑毛茶的堆垛发酵和“发花”工序2 个阶段。通过PCR-DGGE［41］和Illumina MiSeq高通量测序［41-46］等免培养技术研究茯砖茶群落结构及动态变化，确定在整个发酵过程中主要菌属如表1所示。

茯砖茶中的黑毛茶堆垛发酵过程中，优势真菌包括塞伯林德纳氏酵母属、Uwebraunia、曲霉属和unclassifiedPleosporales。在这些优势真菌中，塞伯林德纳氏酵母属最为丰富，它的相对丰度从最初的32.63%显著增长至发酵后期的95.52%。而Uwe-braunia真菌属从最初的16.37%显著降低至发酵后期的1.64%。曲霉属和unclassified_Pleosporales在发酵前期显著降低，分别从11.57%降低至0.33%和从29.35%降低至5.18%；且之后保持相对稳定至发酵结束。克雷伯氏菌属是发酵过程中唯一的优势细菌，其相对丰度从最初的81.99%逐渐上升至发酵后期的99.06%。乳杆菌属是次优势细菌，其相对丰度从最初的6.88%显著降低至后期的0.41%［46］。与其他类型的黑茶相比，茯砖茶在堆垛发酵之后需要经历1 个独特的微生物发酵工序，称之为“发花”。在“发花”工序中，“金花”会在茯砖茶内部大量繁殖；基于形态学、DNA 序列和多基因序列的系统发育学鉴定，“金花”实际上是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的金色闭囊壳；在新的分类中冠突散囊菌已被更名为冠突曲霉（Aspergillus cristatum）［50］。“发花”被认为是一种特别的发酵过程，在特殊处理下冠突曲霉成为茯砖茶中唯一的优势真菌［50-52］，可以分泌α-淀粉酶、多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、蛋白酶和其他半纤维素酶等多种酶，这些酶可以通过促进特定生物活性化合物的形成来提高茯砖茶的品质［41］。此外，“金花”和冠突曲霉也在其他类型的黑茶如普洱茶、黑砖茶、千两茶和六堡茶中被检测到［49，53］，不过含量很低，不是优势菌。

3）其他类黑茶。与普洱茶（熟茶）和茯砖茶相比，关于其他类黑茶如六堡茶、青砖茶等的发酵微生物群落组成和动态变化方面的研究较少。Wang等［47］通过Illumina miseq 高通量测序技术研究六堡茶发酵过程中微生物群落结构及动态变化，共鉴定到真菌581 属和细菌341 属，其中主要优势菌属包括真菌的曲霉属、芽生葡萄孢酵母属和Rasamsonia等，以及细菌的葡萄球菌属、unclassified_Enterobacteriaceae、短状杆菌属、短杆菌属、Pluralibacter、Carnimonas、乳杆菌属和考克氏菌属等。发酵过程中优势菌落演替，早期以鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，23.68%）、甲基杆菌属（17.67%）、金黄杆菌属（Chryseobacterium，12.55%）、曲霉属（16.70%）、枝孢属（Cladosporium，8.36%）、青霉属（6.07%）和芽生葡萄孢酵母属（1.54%）为主，后期阶段演替为葡萄球菌属（59.05%）、短状杆菌属（9.66%）、考克氏菌属（9.81%）、芽生葡萄孢酵母属（65.07%）、曲霉属（21.10%）和Rasamsonia（11.06%）［47］。张丹丹等［54］通过可培养方法研究青砖茶发酵过程中微生物的种类与变化，结果显示在青砖茶渥堆发酵过程中以细菌数量最多，放线菌、霉菌其次，酵母菌最少；研究结果还表明发酵过程中不同堆层间微生物数量差异大，霉菌、酵母菌的数量在渥堆发酵前期的上层样中最多，细菌、放线菌数量在渥堆发酵后期的上层样中最多。Hu 等［48］通过Miseq Illumina 高通量测序技术分析青砖茶发酵过程中微生物群落结构及动态变化，发现真菌37属，其中曲霉属是青砖茶渥堆过程的绝对优势菌，相对丰度在38.1%～75.1%，青霉属、塞伯林德纳氏酵母属、德巴利酵母属、假丝酵母属（Candida）、嗜热丝孢菌属、Rasamsonia、嗜热子囊菌属（Thermoascus）和丝衣霉属（Byssochlamys）分别在不同时期出现，中后期优势菌属为丝衣霉属。

2.2 其他茶类微生物

除黑茶加工外，还发现微生物对红茶、白茶等茶类的品质形成具有一定的影响。在红茶加工过程中，霉菌、酵母菌等具有生成α-淀粉酶、纤维素酶等酶类、促进氨基酸转化、提高可溶性糖含量以及促进花香甜味的形成等作用，能够增进茶汤香气和滋味。红茶加工中部分纤维素降解菌能够将芽叶中的纤维素降解为纤维二糖，再进一步转化为葡萄糖，最终减轻茶叶的粗老味而增加甜醇鲜爽味［55］。白茶加工过程中，接种冠突曲霉菌可明显降低白茶苦涩味（酯型儿茶素总量降低），同时“发花”赋予白茶陈醇滋味［56］。

2.3 茶饮料微生物

微生物发酵茶饮料是以茶叶为底物、通过微生物的生理代谢作用能够形成特定风味与品质的一类茶饮料［57］；这不仅能够解决中低档茶叶的滞销问题，又可以满足人们对健康功能型饮料的需求。用于茶饮料发酵的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和食用真菌等，目前微生物茶饮料通常用细菌和真菌进行混菌发酵制作而成。最具代表性的微生物发酵茶饮料是红茶菌，其大多以红茶为发酵原料，少数使用绿茶和普洱茶，参与发酵的微生物主要是酵母、醋酸菌和少量乳酸菌［58-59］。此外，还有微生物发酵的茶醋饮料、茶酒饮料等。

3 茶叶卫生微生物

在鲜叶采摘、加工、包装和贮运全过程中，微生物都有可能对茶叶造成污染，甚至可能在适宜环境条件下生长并产生毒素，危害人类健康［39］。近年来的研究发现，红茶、绿茶和黑茶等类成品茶叶中都存在产毒真菌污染的情况。红茶成品中检测到的污染真菌以曲霉属为主［60-64］，此外还检测到青霉属、根霉属（Rhizopus）、枝孢霉属、横梗霉属和镰刀菌属等［60，63-64］。黑茶成品中检测到的污染真菌以杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、棕曲霉等曲霉属真菌［65-68］，以及青霉属的桔青霉（Penicillium citrinum）、鲜绿青霉（Penicillium viridicatum）等真菌为主［65，67-68］。有关绿茶、白茶和乌龙茶等茶类中真菌毒素的研究较少，但也同样存在曲霉属和青霉属优势菌群［60，69-70］。

此外，有研究表明茶叶中的微生物对农药残留有一定的降解作用。洪永聪等［71］从茶树中分离得到1 株对茶轮斑病有抑制作用的枯草芽孢杆菌，具有很强的降解氯氰菊酯的能力。王兆守等［72］定向筛选得到1 株假单胞菌c1f6，具有很强的降解拟除虫菊酯类农药的功能，对有机磷类农药同样具备降解能力。

4 展 望

4.1 梳理茶叶微生物体系，建立茶叶微生物方向

当前很多传统学科在与其他学科相互交叉融合的过程中，得到了快速发展与提升。在茶学学科中，也不断有新技术如光电技术、计算机技术等的融合应用，同样明显促进了茶学学科的发展。尽管微生物早已深嵌入茶树种植管理、茶叶加工、茶叶卫生质量、茶产品开发等方面，但一直发展不足，导致推动茶学学科发展的作用不明显，其原因在于未能提升到一个学科层面来发展。华中农业大学园艺林学学院茶学系率先在茶学本科专业开设了《茶叶微生物产品学》专业选修课程，面向茶学硕士研究生开设了《茶叶微生物专题》专业选修课程（也有其他高校开设有类似课程）；还主编出版了“十三五”规划教材《茶叶微生物产品学》，正在编写农业农村部“十三五”规划教材《茶叶微生物学》，努力将茶叶微生物作为一门学科来建设发展。尽管如此，还需要国内同仁共同对茶叶微生物的学科体系进行梳理，逐步建立茶叶微生物方向，并面向茶学本科生和研究生开设相关课程，积极培养具备茶叶微生物知识的综合性茶学专业人才，促使微生物推动茶学学科更快更好地发展。

4.2 加大茶叶微生物的基础研究

当前对茶叶微生物的基础研究明显不足，导致茶叶微生物相关理论基础不完备，应从以下几个方面加强研究：一是加强茶叶微生物区系研究。对茶园微生物、茶叶加工微生物、茶叶产品质量微生物等方面的微生物区系进行全面研究分析，利用宏基因组学等手段了解不同微生物种群的种类与数量，确定微生物的动态变化规律，明确优势菌的种类与互作关系，确定微生物生长变化与茶树生长、茶产品品质形成、茶叶质量等方面的关系［34，73-77］。二是加强茶叶微生物资源的收集与保藏。需加强对茶叶微生物资源的调查，及时收集保存茶源微生物菌种资源，建立茶叶微生物资源库；同时加强对各种优势菌、特色功能菌的筛选与鉴定，针对利用目标建立茶叶微生物资源亚库［78-79］。三是加强茶叶微生物生物学特性研究。对分离筛选的茶源优势菌或功能菌的培养条件、生长特性、酶学特性、代谢特性等进行全面研究，为更好地利用这些菌株提供基础。四是加强茶叶微生物作用机制研究。利用多组学技术剖析微生物对茶树生长或茶叶加工的代谢组学特征，建立微生物与茶相互作用的代谢图谱，特别是茶树病原菌致病机制、茶树内生菌促进茶树生长的机制、微生物发酵转化形成黑茶品质与功能的机制等方面。同时利用多学科理论相融合，研究黑茶固态发酵理论与动力学，建立黑茶发酵模型，以实现精准定向调控黑茶发酵品质。

4.3 加强茶叶微生物的应用研究

发展茶叶微生物除了加强基础研究，必须加强茶叶微生物的应用研究。一是加强助推传统微生物茶产品生产技术水平提升的应用研究。通过筛选优良菌株、制作菌剂等方式，标准化开发茶树生防菌剂、茶树益生菌剂、黑茶发酵菌剂、茶园含菌有机肥等产品，使传统微生物茶产品的生产逐步实现标准化与现代化，尤其是促使黑茶加工实现全程清洁化、可控、安全、发酵生产［55］。二是加大开发可食微生物茶产品的研究力度。依据色、香、味、功能四大食品特性来进行，利用产香微生物研发不同香型茶产品；利用产糖微生物研发滋味回甘强的发酵茶产品；利用特定微生物研发富含没食子酸、茶氨酸等功能活性成分的茶产品［55，80］。三是加强开发特色非可食微生物茶产品的研究。可开发促进茶树优质高产的茶树生防产品、茶树益肥、茶树促生长剂、茶树抗逆剂等制剂，可研发生产应用于降解农残、缩短发酵时间、形成特色品质等的微生物菌剂等［55］。

4.4 以微生物手段综合开发利用茶资源

当前我国茶资源呈现快速增长的趋势，每年有大量茶资源未及时采摘利用，还有大量的茶产品加工副产物未得到有效利用。传统开发方法对进一步促进大规模开发利用茶资源的作用有限，而微生物技术却可弥补当前新技术手段的不足。微生物的种类丰富，可以产酶、产香，还可以分泌各种活性成分。可以利用微生物发酵茶渣、修剪废弃物、茶果、茶花等制作饲料、生物肥等；可以利用微生物发酵制备表面活性剂、杀虫剂、填充剂等；还可以利用微生物发酵茶资源生产酶制剂、蛋白质、生物材料等［55］。借助微生物可以提升茶资源的利用率，提高茶园综合效益，促进茶产业提档升级。

总之，茶叶微生物发展空间巨大，未来必定会有力促进茶学学科快速发展。