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肽基壳聚糖载纳米银的构建及其抗菌性能研究

2022-10-13甄建斌伊佳佳王龙龙刘翰琳丁欢欢

陕西科技大学学报 2022年5期
关键词:纳米银体细胞壳聚糖

甄建斌, 伊佳佳, 王龙龙, 刘翰琳, 丁欢欢

(1.太原工业学院 材料工程系, 山西 太原 030008; 2.西北大学 化学与材料科学学院, 陕西 西安 710127)

0 引言

抗生素对人类健康的价值毋庸置疑,它的使用改变了人类与细菌感染性疾病长久斗争中的弱势地位[1-2].随着人们卫生安全意识的提高,抗菌试剂的产量和消费量一直在上升.然而,抗菌试剂在临床、农业和畜牧业等方面的滥用导致细菌耐药性不断发展增强,耐药菌的出现使原本有效的抗生素失去其治疗效果,因此增加了治疗难度和医疗成本[3-5].另外,由于耐药基因可在不同菌种之间穿梭而造成多重耐药菌,使大多数传统抗生素对其束手无策[6-8].目前,细菌耐药性问题已成为国际卫生安全棘手的问题之一,需要全人类共同努力去应对[9-10].

生物相容性良好的壳聚糖分子结构中含有大量的活性基团氨基(-NH2),氨基在溶液中质子化后可赋予其杀菌功效[11-15].然而,在实际应用中,由于壳聚糖的水溶性较差,这大大限制了其应用范围[16-21].另外,纳米银(AgNPs)也是公认的最具有潜力的抗菌剂之一,但AgNPs在溶液中易团聚沉降的缺点使其应用受到很大限制[22-28].基于此,本课题先采用亲疏水氨基酸对壳聚糖改性以制得两亲性肽基壳聚糖Peptide-based chitosan(PBC),再通过对Ag+的原位还原实现对AgNPs的稳定固载,最终制得肽基壳聚糖载纳米银抗菌材料(PBC@AgNPs).这种新颖结构的阳离子特征的PBC载体就像“纳米弹”可通过静电作用致密地富集在带负电的菌体膜表面,从而改变细胞膜的通透性和膜电位,同时可提高AgNPs的有效聚集浓度,最终实现AgNPs和PBC载体之间的协同增效抗菌作用,这种独特的抗菌模式与传统抗生素不同,具有不易产生耐药性的优势.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂:

N-ε-苄氧羰基-L-赖氨酸购自北京aladdin公司;亮氨酸、三光气、头孢曲松、氢溴酸(70 wt%的乙酸)、三氟乙酸、碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),购自上海阿拉丁化学试剂有限公司;胎牛血清,胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉购自西安科昊生物有限公司.四氢呋喃、正戊烷、乙醚、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自上海泰坦科技股份有限公司,使用前蒸馏干燥.上述化学试剂均为分析纯.

1.1.2 主要仪器

Agilent-8453紫外-可见分光光度计,美国安捷伦科技公司;370型傅里叶变换红外光谱仪,美国Nicolet Avatar公司;YX600W卧式圆形电热蒸汽消毒器,上海市三申医疗器械公司;Ti-UX型荧光倒置显微镜,日本Nikon公司;TMJ-2150型恒温霉菌培养箱,陕西天美科学仪器公司;Beckman coulter Avanti J-E离心机,美国贝克曼库尔特公司;FD-1C冷冻干燥机,北京博医康实验仪器公司;扫描电子显微镜,日本Hitachi公司.

1.2 实验方法

1.2.1 肽基壳聚糖聚合物的合成

根据本课题组之前的报道[29],分别合成Lys-Cbz-NCA和Leu-NCA单体,合成路线如图1所示.通过氨基酸-NCA的开环聚合反应合成肽基壳聚糖peptide-based chitosan (PBC).首先,分别称取6.12 g Lys-Cbz-NCA和1.57 g Leu-NCA 加入100 mL过膜的壳聚糖DMF(0.01 g/mL)溶液中.在50 ℃,N2保护下反应72 h,反应液在过量乙醚中沉析.将所得中间产物充分溶于三氟乙酸中(10 mg/mL),再加入过量的氢溴酸(70 wt%的乙酸),在室温下搅拌12 h,再在过量乙醚中沉析,经透析(MWCO:8000)、冷冻干燥,得到肽基聚合物PBC,合成路线如图2所示.

图1 氨基酸-NCA的合成路线

图2 PBC的合成路线

1.2.2 肽基壳聚糖载纳米银的制备

称取9 mg肽基壳聚糖PBC溶于3 mL四氢呋喃中,将其缓慢滴加到6 mL去离子水中并充分搅拌6 h,随后再加入AgNO3溶液(1 mL,0.1 M).在避光条件下匀速搅拌3 h,使肽基壳聚糖结构中的-NH2等杂原子与Ag+充分配位、络合,将Ag+吸附在PBC分子结构中,然后缓慢滴入1 mL NaBH4(0.5 M),将吸附在PBC位点上的Ag+还原成零价银原子(Ag0),继续搅拌4 h,Ag0在原吸附位点上(原位)生长为银寡聚簇,随着时间的延长,寡聚簇银继续生长为AgNPs,再经去离子水透析48 h,最终制得肽基壳聚糖载纳米银复合材料(PBC@AgNPs),如图3所示.此方法将抗菌PBC作为基体,不仅实现了对AgNPs的成功负载,而且克服了单独使用纳米银时易团聚沉降的缺陷,同时达到了PBS与AgNPs协同增效的杀菌目的.

图3 PBC@AgNPs的制备示意图

1.3 性能测试与表征

1.3.1 PBC@AgNPs和细菌细胞的表征与分析

采用FT-IR和UV-vis分别对PBC和PBC@AgNPs进行表征.PBC的相对分子质量采用GPCmax+TDA305型Viscotek TDAmax科研级多检测器凝胶渗透色谱系统测定;设置流动相为NaNO3溶液(0.12 mol/L,1.0 mL/min,50 μL).通过扫描电子显微镜SEM(SU8010)观察 PBC@AgNPs及菌体细胞经PBC@AgNPs作用前后的形貌,将配制浓度为1 mg/mL的PBC@AgNPs溶液,滴置单晶硅片,冷冻干燥.将样品喷金处理后,在3.0 keV的加速电压下观察样品形态.

1.3.2 抗菌性能测试

(1)最小抑菌浓度(MIC)测定:根据本课题组之前报道[11],采用肉汤稀释法在无菌96孔板中测定PBC@AgNPs的MIC以评价其抗菌活性;MIC值为肉眼可见混合悬浮液出现澄清透亮时PBC@AgNPs所对应的最低的浓度.将E.coli(BL21),P.aeruginosa,K.pneumonia,MRSA(ATCC43300),VRE和S.aureus(ATCC29213)作为测试菌株.首先将测试菌株单克隆菌落接种到10 mL MH培养基中,培养至细菌溶液OD600值达到0.8时,再稀释至106CFU/mL备用.在无菌96孔板中加入100 μL不同浓度的PBC@AgNPs溶液,再加入100 μL备好的菌液,在37 ℃下过夜培养.其中,不含菌液的MH培养基(200 μL)和不含PBC@AgNPs的菌液(200 μL)作为对照,每组实验至少平行重复3次.

(2)最小杀菌浓度(MBC)测定:MBC是指杀死99%以上细菌所对应抗菌剂的最低浓度.在上述测试 PBC@AgNPs的MIC的96孔板中,从大于MIC浓度以上孔中分别吸取50 μL的混合液,将其稀释105倍,随后分别吸取10 μL后直接均匀涂抹至固体培养基上,在37 ℃恒温培养箱中培养16 h.以未经过PBC@AgNPs处理的菌液作为空白对照.最后,计数培养基上菌落形成单位(CFU),记为CFU/mL,经计算得出PBC@AgNPs的MBC.

1.4 抗菌机理研究

1.4.1 细菌形貌分析

为了从微观角度研究PBC@AgNPs对细菌细胞的抗菌机制,通过SEM观察细菌经PBC@AgNPs作用前后的形态.以未经PBC@AgNPs处理的细菌细胞作为对照.先将测试菌株培养至对数生长期,然后用PBC@AgNPs作用8 h.收集菌体细胞重悬在PBS中,随后在2.5%的戊二醛溶液中进行固定.再收集菌体细胞,用梯度浓度的乙醇溶液对菌体细胞脱水,并用叔丁醇置换乙醇.最后将悬浮液滴加在单晶硅片上,干燥、喷金观察.

1.4.2 荧光染色实验

为了进一步探究细菌经PBC@AgNPs作用后,细胞膜是否完整,选用DAPI和PI对菌体细胞进行荧光染色标记.首先,将完好的细菌单克隆在37 ℃下培养至对数生长期(OD600=0.4~0.6),并用浓度为2×MIC的PBC@AgNPs作用8 h.然后经离心收集菌体细胞,并用PBS洗涤3~4次,再收集细胞与PI(5 μg/mL)在0 ℃避光条件下静置15 min.DAPI的染色过程同上.以未经PBC@AgNPs作用的细菌细胞作为对照.

1.4.3 活性氧簇(ROS)的测定

PBC@AgNPs在杀菌过程中释放的AgNPs可以促发ROS的产生,导致低氧应激反应等多种机制进而抑制细菌的繁殖.为了探究PBC@AgNPs的杀菌机制,通过流式细胞仪检测经PBC@AgNPs作用前后菌体内ROS量的变化.将处于对数生长期浓度为5×106CFU/mL的细菌悬浮液与不同浓度的PBC@AgNPs溶液混合,在37 ℃下孵育8 h.随后加入氧化应激指示剂DCFH-DA(10.0 μM)培养1 h,通过离心、洗涤后,利用流式细胞仪检测不同菌体细胞的荧光强度,以分析细胞内ROS的含量.

1.5 耐药性评价

细菌经常暴露于抗生素环境时会逐渐产生抗药性.为了评价PBC@AgNPs是否容易诱导细菌产生耐药性,将PBC@AgNPs浓度为1/2 MIC孔中的细菌在37 ℃下培养至对数生长中期(OD600=0.4~0.6),稀释至5×106CFU/mL,与不同浓度的PBC@AgNPs溶液混合后加到无菌96孔板中培养.在37 ℃下孵育16 h,得到PBC@AgNPs新的MIC值.重复上述实验连续传代14次,通过分析每次得到的MIC判断测试菌株是否产生了耐药性.以市售抗生素头孢曲松作为对照.

1.6 体内抗菌活性评价

通过建立小鼠腹腔感染模型评价PBC@AgNPs的体内抗菌效果.以5~7周龄,20 g左右的昆明雄性小鼠作为研究对象.用革兰氏阳性菌S.aureue(ATCC29213)和革兰氏阴性菌E.coli(BL21)分别将不同组小鼠感染,待不同处理后,监测不同组别中小鼠脏器(心、肝、脾、肺、肾)内菌落数变化,从而评价PBC@AgNPs的体内抗菌活性.先将感染菌培养至OD600=0.8~1.0,再用无菌生理盐水重悬至OD600=0.8.将小鼠随机分成对照组1(Group 1)和实验组2(Group 2),每组小鼠6只.分别对Group 1和Group 2中的小鼠进行腹腔感染,2 h后分别注射生理盐水和PBC@AgNPs溶液(350 μL,0.4 mg/mL).对所有测试小鼠等时等量连续注释 3 d,每12 h一次,随后解剖取其脏器,充分研磨,吸取10 μL匀浆液均匀涂抹于LB琼脂培养基上,在37 ℃恒温培养箱中培养约16 h.通过菌落计数法(CFU/mL)评估PBC@AgNPs的体内抗菌活性.

2 结果与讨论

2.1 肽基壳聚糖的表征

通过氨基酸-NCA的开环聚合制得PBC,通过傅里叶红外光谱仪对PBC进行结构表征,以分析其结构.肽基壳聚糖PBC的红外光谱图见图4所示,3 520 cm-1和2 860 cm-1附近的峰对应PBC中-OH、-NH2和-NH-的伸缩振动吸收峰;2 930 cm-1左右的峰是聚合物结构中-CH3、-CH2-的伸缩振动吸收峰;1 670 cm-1处的峰是PBC的酰胺基团中羰基(-C=O)的伸缩振动吸收峰,该特征峰是由壳聚糖分子中的-NH2对氨基酸-NCA开环聚合物后形成的新的酰胺基团的特征峰;1 450 cm-1左右的特征峰对应-CH2-的吸收峰,1 350cm-1处的峰是-C-N-的特征峰,1 090 cm-1处的吸收峰来源于分子结构中-C-O-的伸缩振动.分析以上红外光谱图说明本实验成功制得了PBC.

图4 PBC的红外光谱图

肽基聚合物PBC的相对分子量通过GPC测定.配置PBC浓度为8 g /L,测试温度为30 ℃,测得PBC的Mw为45 167,Mn为39 166,分散度为1.15,由此说明PBC分子量分布较均一.

2.2 肽基壳聚糖载纳米银的表征

从图5中插图所示的a瓶可以看出,PBC@AgNPs溶液呈现黄棕色,图5中插图所示的b瓶显示PBC溶液成无色状态,根据文献[27]报道,该结果说明本实验成功制得了纳米银AgNPs.而且,该溶液在室温避光条件下下静置保存2 mth后,其溶液状态良好,呈现均一透亮状,更没有沉淀出现,该溶液经动态激光散射仪测得PBC@AgNPs的粒经约为270 nm,分散系数PDI为0.67, 由此说明AgNPs被PBC稳定负载且PBC@AgNPs在溶液中具有较好分散性和稳定性,这克服了AgNPs在溶液中团聚沉降的缺陷.同时,通过UV-vis分别对PBC和PBC@AgNPs进行表征,结果如图5所示,PBC在紫外可见光谱350~600 nm之间没有吸收峰,而PBC@AgNPs在420 nm左右有明显吸收峰,再次确认AgNPs的成功制备.

图5 PBC@AgNPs的紫外可见光谱吸收图(插图为其在水溶液中的状态)

2.3 PBC@AgNPs的形貌分析

壳聚糖经赖氨酸和亮氨酸改性后具备两亲性结构,其在溶液中可以通过自组装形成纳米结构,从而提高其正电荷密度,达到增强杀菌活性的效果.通过SEM观察PBC@AgNPs的形貌,结果如图6所示,该纳米颗粒为分散型球形纳米颗粒,尺寸约为250±10 nm.

图6 PBC@AgNPs的SEM图

2.4 抗菌性能分析

从表1中数据可以看出,PBC@AgNPs具有良好的广谱抗菌效果,MIC在6~12 μg/mL之间,MBC值在10~18 μg/mL之间,且灭菌率均在95%以上.其中,对革兰氏阳性菌S.aureus(ATCC29213)的抗菌效果最好,MIC值为6 μg/mL,MBC值为10 μg/mL,对耐药菌VRE和MRSA的MIC值分别为8 μg/mL和10 μg/mL,MBC值分别为12 μg/mL和16 μg/mL.对革兰氏阴性菌也显示出良好的抗菌效果,其MIC和MBC值分别为6~12 μg/mL和12~18 μg/mL.由此说明,将AgNPs负载到PBC分子中,可以达到协同增效的灭菌目的.

另外,从表1数据可以看出PBC@AgNPs对革兰氏阳性菌较阴性菌具有更好的抗菌效果,这可能是由于在革兰氏阴性菌的肽聚糖层外还有一层可以起保护作用的外层膜脂多糖(LPS)所致,这种额外的LPS在一定程度上阻碍了PBC@AgNPs的杀菌作用.

表1 PBC@AgNPs的抗菌活性

2.5 抗菌机理研究

为探究纳米颗粒PBC@AgNPs的抗菌机制,通过SEM观察其对菌体细胞形态的影响.以未经PBC@AgNPs作用的细菌细胞作为对照.从图7(a)、(b)中观察到,在没有PBC@AgNPs的情况下,细菌细胞都具有完整光滑的表面.然而,当以浓度为2×MIC的PBC@AgNPs作用细菌细胞后,细菌形貌发生了明显改变,如图7 (c)、(d)所示,作用8 h后,细菌结构被严重破坏,膜表面出现了褶皱,细胞实体结构已经完全坍塌并破裂.由此说明,PBC@AgNPs确实可以机械性地损坏菌体细胞形貌,造成细菌不可逆转地凋亡.

图7 细菌细胞经PBC@AgNPs作用前后的SEM图

为了进一步探讨抗菌纳米颗粒PBC@AgNPs对细菌的作用机制,采用DAPI和PI荧光染色实验监测细胞膜通透性的变化.如图8所示,未经PBC@AgNPs作用的细菌细胞,用DAPI孵育后发出蓝色荧光(图8(a1)、(a2)),而经PI孵育后均没有发出红色荧光(图8(b1)、(b2)),说明测试细菌细胞膜完好.然而,经PBC@AgNPs作用后的两种细菌再与DAPI作用后发出了蓝色荧光(图8(c1)、(c2)),其与PI共混后明显发出红色荧光(图8(d1)、(d2)),该结果证实菌体细胞经纳米颗粒作用后,细菌膜的结构确实受损,其通透性发生了改变.

图8 MRSA(ATCC43300)和E.coli (BL21)的荧光染色图

PBC@AgNPs中具有“粒子效应”的AgNPs可通过破坏细菌细胞膜结构进入细胞内,随后释放的Ag+可以与蛋白质结构中的-SH、二硫键等基团结合,进而破坏其生理活性.特别是Ag+可以诱发菌体细胞内ROS的产生,进而产生强效抗菌作用.通过DCFH-DA衡量细菌经PBC@AgNPs作用前后菌体细胞内ROS含量的变化.结果如图9所示,菌体细胞内ROS的含量随着PBC@AgNPs用量的增加而增加;当PBC@AgNPs的浓度为9 μg/mL时,细胞内ROS的量增加了近15倍;由此说明在PBC@AgNPs的杀菌过程中,AgNPs确实发挥了不可忽视的抗菌作用.

图9 菌体细胞内ROS的含量

2.6 细菌耐药性评价

耐药细菌,特别是多重耐药细菌对传统市售抗生素都表现出了抗性,人类安全健康面临着巨大挑战.因此,评估细菌对PBC@AgNPs的抗性是非常必要的.在含PBC@AgNPs(1/2 MIC)的培养液中对细菌连续传代14次,测定每代细菌的MIC值.以头孢曲松作为对照.测试结果如图10 (a)、(b)所示,对于S.aureus(ATCC29213),头孢曲松的MIC值在第3传代后就增加了近3倍,传代14次后增加了近25倍.对于E.coli(BL21),头孢曲松的最小抑菌浓度在第4次传代后出现了抗药性,在第14代后提高了近22倍.然而,这两种不同测试菌株连续传代14代后,PBC@AgNPs对两种细菌的MIC值基本没有发生大幅度变化,更没有明显增加.由此表明,测试菌株S.aureus(ATCC29213)和E.coli(BL21)对抗生素头孢曲松产生了明显耐药性,而PBC@AgNPs纳米抗菌颗粒不会诱导细菌细胞产生抗药性.

图10 不同细菌细胞对PBC@AgNPs的耐药性评价

2.7 体内抗菌评价

通过小鼠腹腔感染模型进一步评价PBC@AgNPs纳米抗菌颗粒体内的抗菌效果.从图11(a)、(b)可以看出,在Group 1中都有明显的菌落生长,且菌落数较大,说明小鼠的检测组织(心、肝、脾、肺、肾)在3 d内一直处于感染状态,自身免疫系统不足以抵抗该菌感染.然而,Group 2中的小鼠经PBC@AgNPs连续治疗后,各内脏组织研磨液中菌落数的减少明显非常,该结果说明PBC@AgNPs在体内依然具有很好的抗菌效果.

图11 小鼠体内不同组织的菌落数变化(Heart:Hea.; Liver:Liv.; Spleen:Spl..; Lung:Lun.; Kidney:Kid.)

3 结论

为了应对细菌耐药性,以壳聚糖为引发剂,通过对氨基酸-NCA的开环聚合合成了肽基壳聚糖(PBC),并通过对Ag+的络合、原位还原实现了对纳米银(AgNPs)的稳定负载,最终制得PBC@AgNPs,其尺寸约为250 nm(+26.7 mV)左右的纳米颗粒.抗菌性能评价显示,该纳米颗粒具有很好的广谱抗菌活性,其MIC值在6~12 μg/mL之间,杀菌率均超过了95%.经SEM、荧光染色和ROS机理探究显示,PBC@AgNPs能不可逆转地破坏菌体细胞膜结构、通透性,同时促发胞内ROS的释放,导致低氧应激反应等多种机制联合杀菌,这种杀菌模式使即使是多重耐药菌也难以抵抗,最终致细菌不可逆转地凋亡.小鼠体内感染模型表明,PBC@AgNPs在体内也具有良好的抗菌活性.PBC@AgNPs这种独特的抗菌机制使细菌没有机会对其产生耐药性,这为有效应对细菌耐药性提供了一种安全有效的潜在策略.

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