柑桔鳞皮病研究进展

乔兴华，陈 力，孙海均，易天凤，张 昕，杨 祥

(1 重庆市万州区植物保护与果树技术推广站，重庆，404120；2 重庆市万州区黄柏乡农业服务中心，重庆，404031)

柑桔是世界第一大水果，年产量约1亿t。作为世界第一大柑桔生产国，中国的柑桔栽培面积超过260万hm2，产量4 500万t以上[1]。虽然近年来我国柑桔无病毒良种苗木繁育规模不断扩大(其中，重庆已成为全球最大的柑桔良种无病毒种苗生产、销售集散地之一)，但果农自主育苗和无认证苗圃育苗仍然数量众多，且普遍缺乏规范，加快了柑桔碎叶病、茎陷点型衰退病、柑桔黄脉病等柑桔病毒病随苗木扩散的速度，导致其在中国部分柑桔产区暴发，损失严重[2-3]。

柑桔鳞皮病是已知最古老的柑桔病毒病，可侵染大多数柑桔类型，为害严重时减产超过40%[4]。该病在我国国内少有报道，然而，近年来在我国多个柑桔产区陆续检测出柑桔鳞皮病，暴发风险加剧。鉴于此，笔者就该病的相关研究进展作一综述，为今后开展柑桔鳞皮病的监测和防治提供参考。

1 发生历史及范围

19世纪90年代在美国佛罗里达和加利福尼亚发现了一种柑桔新病害，该病造成植株老叶出现斑驳黄化症状、树皮呈鳞片状开裂，被称为鳞皮病[5]。随后，在西班牙、意大利、土耳其、希腊等地中海沿岸国家，阿尔及利亚、南非、贝宁、尼日利亚等非洲国家，以及阿根廷、乌拉圭、澳大利亚、墨西哥等国陆续发现了该病[6-11]。通过执行严格的检疫措施，该病在大多数种植柑桔的发达国家已得到了有效控制。柑桔鳞皮病在各国的发生程度存在差异，例如，柑桔鳞皮病在意大利的传播速度高于其他地中海国家[12]。陈国庆等[13]曾利用指示植物法等方法鉴定认为引自摩洛哥的脐血橙植株感染了柑桔鳞皮病，邱柱石等[14]曾报道广西的一株宫川温州蜜柑及一株暗柳橙(在宫川温州蜜柑上高接)感染了柑桔鳞皮病，但都未开展进一步验证研究。近年，李敏等[15-16]研究发现，湖南、云南等地部分杂柑品种感染了柑桔鳞皮病。表明，该病已传入中国，扩散风险大。

2 症状和品种敏感性

根据症状差异，鳞皮病被分为了鳞皮病A和鳞皮病B[17](见图1)。其中，鳞皮病A较为常见，引起主干和侧枝呈鳞片状开裂、流胶位点凹陷、木质部褐变。鳞皮病B的为害更为严重，主要表现为幼枝充胶，枝条甚至是小枝的树皮大面积呈鳞皮状开裂，嫩叶呈橡形叶症，老叶褪绿斑驳、叶背面有褐色脓疱，果实上有时有环斑[4]。不同于大多数已知的柑桔病毒类病害，植株感染鳞皮病后长期隐症，10～12年后才会表现出显著的树皮开裂症状[4-5]。此外，高温处理会降低病株中的病毒含量，进而症状减弱[18]。该病可侵染大多数的柑桔类型，其中，以宽皮柑桔、葡萄柚和甜橙最为敏感；酸橙、柠檬、柚和粗柠檬较为耐病，发病后只表现出叶部症状[4]。

图1 柑桔鳞皮病A和鳞皮病B田间症状[17]

3 病原特征

柑桔鳞皮病的病原为柑桔鳞皮病毒(Citruspsorosisvirus，CPsV)，是蛇形病毒属(Ophiovirus)的代表种[19]。病毒粒子被裸露的线形核衣壳包裹，直径3～4 nm，可形成卷曲的环，呈扭曲的线状。通过蔗糖梯度密度离心可分离出长度为700和2 000 nm的两种组分，其各含有CPsV基因组的一部分，只有两部分同时存在时病毒才具有侵染能力[19-20]。CPsV基因组全长11.3～2.5 kb，其3’端较为保守，但5’端变异大[21]。CPsV基因组具有3条负单链RNA。其中，RNA1的互补链含有2个开放读码框，分别编码1个被109 nt间隔区分隔开的、功能未知的24 kDa蛋白，以及1个具有5个保守结构域的280 kDa蛋白，该蛋白被认为是依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)的一部分[22]。RNA2和RNA3的互补链分别编码54 kDa的运动蛋白(MP)[23]和48.6 kDa的外壳蛋白(CP)[24]。

4 对寄主结构的影响

CPsV主要分布于柑桔的韧皮部和薄壁细胞中，但在植株中的分布并不均匀[4，25]。植株感染CPsV后，上表皮会出现一种非结构的薄壁组织，栅栏组织层数和油胞减少，且缺乏含晶体异母细胞。此外，病株的韧皮部和木质部变薄，导管直径降低，植株的输导能力严重受损[26]。在受感染的细胞中，还会出现大量畸形的叶绿体和线粒体，细胞外形异常，细胞核肥大[26]。

5 传播途径

柑桔鳞皮病是第一种被证明可通过无性繁殖传播的柑桔病毒病，带病苗木和接穗是重要的传播途径[27]。有研究显示，来源于阿根廷、美国、埃及的部分CPsV毒株可通过机械接种的方式在柑桔间、在柑桔与藜麦等草本寄主间以及在昆诺藜、千日红等草本寄主间传播[4，28-29]。田间调查表明，植株根部的自然接触似乎也是柑桔鳞皮病传播的有效途径[30]。根据柑桔鳞皮病在美国、阿根廷、乌拉圭的传播特点推测其存在传播媒介，虽然早期有研究认为褐色桔蚜、桔二叉蚜、绣线菊蚜以及类似Olpidiumsp.的真菌是柑桔鳞皮病的传播媒介，但都缺乏相关试验证据[31-32]。此外，柑桔鳞皮病虽可通过种子传播，但传播能力极低，对病害流行的影响很小[33]。

6 检测方法

6.1 指示植物鉴定指示植物是鉴定柑桔鳞皮病的重要手段，其中麦达姆维纳斯甜橙、尤力克柠檬、凤梨甜橙、Citrusexcelsa实生苗和粗柠檬砧香橼被作为指示植物用于柑桔鳞皮病的鉴定[34]。进行指示植物鉴定时，所需的最低温度为16～18 ℃，最高温度27～30 ℃。低温有利于新梢出现“休克”症状，同时嫩叶的褪绿症状更加明显，而高温会抑制症状的表现[35]。由于柑桔碎叶病毒(Citrustatterleafvirus，CTLV)等柑桔病毒在上述指示植物上也会引起叶片黄化、卷曲等类似症状，因此，在用指示植物鉴定柑桔鳞皮病时，还需要接种强毒株CPsV-B，通过交叉保护的方式进行进一步的验证[36]。

6.2 血清学检测目前已建立了多种以CPsV CP为靶标的血清学方法用于柑桔鳞皮病检测。其中，直接组织点免疫法(DTBIA)对老叶中CPsV的检测效率低于双抗体夹心法(DAS-ELIASA)和三抗体夹心法(TAS-ELISA)，但3种方法对幼嫩组织中病毒的检测灵敏度相同，且DTBIA法更为便捷，适合对田间样品的快速初筛[34]。此外，用辣根过氧化物酶(HRP)代替碱性磷酸酶(AP)后建立的TAS-ELISA-HRP法，反应时间从20 h左右缩短为30 min，且检测灵敏度与RT-PCR法相当[6]。根据CP抗原决定簇差异制备的单克隆抗体，还可用于区分不同来源的CPsV毒株[37]。

6.3 探针法P32标记的全长CP基因曾被作为探针被用于检测CPsV，但在反应温度低于55 ℃时，检测效果不佳[23]。改用地高辛来标记探针后解决了这一问题[38]。探针法的检测效率高于血清学检测法，全年都可从病株的任意组织中检测出CPsV，但以春季花、嫩叶中的检出率最高。近年来，基于电子探针的生物信息学法被用于同时检测包括CPsV在内的11种全球重要的柑桔病毒，极大提高了检测效率[39]。

6.4 PCR检测方法随着CPsV毒株CPV-4序列的测定，以此为基础，建立了针对CP基因的RT-PCR检测方法[24]。为提高对不同CPsV毒株的检测灵敏度，发展出了巢式RT-PCR法，其灵敏度较RT-PCR法提高了106倍[40]。但巢式RT-PCR法存在操作繁琐、容易出现假阳性的缺点。吕婵娟等[25]和Achachi等[41]在前期研究的基础上对RT-PCR法进行了改进，提高了检测的灵敏度和可靠性。近年来RT-qPCR法也被用于检测CPsV，其灵敏度较RT-PCR法提高了102～103[42-43]，并且多重RT-qPCR法可还同时检测CPsV、柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)和柑桔叶斑驳病毒(Citrusleafblotchvirus，CLBV)等多种柑桔病毒，进一步提高了检测效率[44]。此外，RT-LAMP法因具有不需要特殊仪器，适用于田间现场检测等特点，也开始被运用于CPsV的检测[16]。

7 防治方法

7.1 常规防治目前尚无治疗柑桔鳞皮病的药剂，因此预防是防控此病害最重要的环节。通过茎尖嫁接脱毒、热处理等方法获得无病毒母树，进而繁育和使用无病苗木是目前防治柑桔鳞皮病最有效的手段[45]。此外，有研究者发现，从宽皮柑桔、甜橙和德威特桔橙柱头和花柱外植体再生出的体细胞胚不含有CPsV，这为脱除CPsV提供了新的途径[46-47]。由于CPsV-A毒株对CPsV-B毒株具有拮抗作用，因此预先接种致病力相对较弱的CPsV-A毒株可减低强毒株CPsV-B对植株的为害[4]。

7.2 抗病育种迄今尚未发现对鳞皮病有抗性的柑桔品种，因此传统杂交抗病育种难度大。当前已获得了表达CPsVCP基因的葡萄柚、甜橙和卡里佐枳橙转基因植株，其中，转基因甜橙植株对CPsV表现出了一定的抗性[48-49]。转录后的基因沉默(PTGS)可能是转基因植株产生柑桔鳞皮病抗性的主要原因。Reyes等[50]将分别含有CPsVCP基因、54K基因和24K基因的发夹结构转入凤梨甜橙后发现，表达CP基因发夹结构的转基因甜橙对CPsV的抗性最强。在此基础上，Francesco等[51]通过改进发夹结构，大幅提高了转基因植株的抗病能力，即使再次接种强毒株CPsV-B，转基因植株仍能抵御病毒侵染2年以上。此外，通过这种方法产生的抗性，可通过嫁接的方式从转基因砧木传递到非转基因的接穗上[52]。

8 结语

柑桔鳞皮病作为最古老的柑桔病毒病，已对世界柑桔产业造成了重大损失。近年来在我国湖南、云南等地的多个杂柑品种上陆续检测出柑桔鳞皮病毒，而当前杂柑种植热度仍然很高，且果农普遍缺乏防范意识，因此该病在我国暴发的风险较高，需要引起重视。此外，由于尚无有效的防治药剂，选用无病苗木是防治柑桔鳞皮病最重要的措施。