微塑料-多环芳烃对农用地土壤微生物群落结构和功能的影响

刘沙沙，操江飞，陈显宇，梁绮彤

（肇庆学院环境与化学工程学院/广东省环境健康与资源利用重点实验室，广东 肇庆 526061）

【研究意义】塑料及其制品因具有耐用性、成本低等优点而被人们广泛应用于生产和生活中，但塑料垃圾的不当处理会对环境造成严重污染。大块塑料经过物理、化学和生物作用后逐渐破碎成尺寸更小的细小颗粒，当粒径小于5 mm时称为微塑料；微塑料还被应用在原料、药物和个人护理品等工业化产品中，这些也是环境中微塑料的重要来源。陆地环境是微塑料更重要的“汇”，微塑料含量可能是海洋中的4～23 倍［1］。此外，随着工业化进程的加快，环境中多环芳烃（PAHs）的含量逐渐增加。2014 年《全国土壤污染状况调查公报》指出，土壤中PAHs 的点位超标率为1.4%。农用地土壤作为人类生存和发展的重要支撑，其微塑料和PAHs 污染问题应引起足够重视。

【前人研究进展】微塑料的化学性质稳定，在环境中具有持久性并可沿食物链进行富集，在生物体内积累产生一定毒性［2］；PAHs 可长期存在于土壤环境中，具有致畸、致癌和致突变效应［3］。由于微塑料较大的比表面积和强疏水性，其可以与共存的PAHs 发生相互作用，呈现出对生物体的复合毒性效应［4］。微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤养分循环、肥力保持和土壤功能维持等方面起重要作用。研究发现，微塑料污染可以改变农田土壤的细菌群落结构等［5-6］；PAHs 污染后的土壤微生物群落组成和活性、酶活性（脱氢酶）、降解基因等会发生变化［7-8］，微生物具有适应性的遗传机制，会逐渐形成可以降解PAHs 的优势菌群，并可以利用包气带土壤中的PAHs 作为碳源或形成共代谢，当PAHs 污染程度较重时，则对微生物产生抑制作用［9-10］。

【本研究切入点】目前微塑料-PAHs 复合污染对土壤微生态影响的研究尚未见报道，而这对于农用地土壤健康风险的评估具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究分别选用聚氯乙烯（PVC）、芘（PY）作为微塑料和PAHs 的代表，进行室内土壤培养实验。利用宏基因组学技术研究PVC-PY 复合污染对农用地土壤微生物群落结构和功能的影响，并基于测序数据进行基因功能预测分析(PICRUSt)，揭示农用地土壤中微塑料和PAHs 污染的潜在微生物生态效应，为农用地土壤中微塑料-PAHs 复合污染的生态风险评估和治理修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样品采自广东省肇庆市高要区金渡镇的农用地（23°2'58″N，112°30'44″E），采用“S”形布点法采集土样，采样深度为0～20 cm，混合均匀后运回实验室，自然风干，去除粗大的石块、残根和凋落物等，过孔径2 mm 筛混匀，备用。

芘（PY）购自Aldrich 公司，纯度为98%；聚氯乙烯（PVC）购自Aldrich 公司，其粒径在200～250 μm 之间；其他试剂为分析纯。

1.2 土壤培养实验设计

将溶于丙酮的芘加入到土壤中，待丙酮完全挥发后加入聚氯乙烯微塑料，充分混匀，装入玻璃烧杯中，土壤含水量保持在田间持水量的60%。具体分组如下：（1）CK，土壤中不加入PVC和PY；（2）PY，土壤中PY 含量为10 mg/kg；（3）PVC，土壤中含0.2%（W/W）PVC；（4）PYPVC，土壤中PY 和PVC 的浓度分别为10 mg/kg和0.2%。每个处理3 次重复。室内土壤培养实验于2019 年6 月开始，在肇庆学院的恒温恒湿培养箱中培养300 d 后取样，一部分放在-20 ℃冰箱中保存，以供微生物高通量测序分析。

1.3 土壤微生物群落宏基因组测序

采用磁珠法提取土壤总DNA，利用裂解液和蛋白酶进行裂解消化，通过结合液和磁珠吸附净化DNA，经洗涤和洗脱后回收DNA，1%琼脂糖凝胶（电压200 V、时间30 min）检测DNA 完整性，Qubit 定量检测DNA 样本浓度，并对样本进行质检；使用Covaris 仪器将DNA 进行片段化，经DNA 片段末端修复、连接接头和磁珠分选纯化连接产物后进行PCR 扩增富集，并进一步经文库纯化和质检合格后，完成文库构建；采用Illumina HiSeq 平台进行高通量测序，对测序的原始数据进行质量评估以获得有效数据，对优质reads 进行拼接组装，使用Prodigal 对拼接的contigs 进行ORF 预测，根据NCBI 的微生物分类学信息数据库，获得基因的物种分类注释信息，并在各个分类学水平上统计物种的结构和相对丰度；进行Gene Ontology（GO）数据库比对分析微生物群落的生物学功能，结合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库对微生物群落的代谢通路进行预测，将基因集蛋白序列与Carbohydrate Active Enzymes (CAZy)数据库进行比对，得到其对应的碳水化合物活性酶注释信息。

2 结果与分析

2.1 聚氯乙烯/芘污染对土壤微生物群落结构的影响

本研究在土壤中检测出2 055 个属分类学水平上的微生物，CK、PY、PVC 和PY-PVC 4 组样品中不同属的菌所占比例具有一定差异（图1）。Huang 等［11］研究表明，低浓度的聚乙烯（PE）微塑料对土壤中细菌群落多样性没有影响，但提高了群落的丰富度；费禹凡［5］发现PE 的存在显著改变了菌落结构，PVC 对一些细菌的相对丰度有增强作用；在土壤中添加PVC、高密度聚乙烯（HDPE）和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)后，细菌群落未发生明显变化［12］。Li 等［13］研究指出微塑料的存在对土壤微生物多样性的影响不明显，但显著增加了微生物数量。这说明微塑料与土壤微生物群落之间的关系十分复杂，可能与土壤的理化性质、微塑料的种类和浓度等有关。但目前关于添加微塑料和PAHs 后，土壤微生物群落结构的变化还未见报道。

图1 PY-PVC 对属水平上微生物群落相对丰度的影响Fig.1 Effects of PY-PVC on relative abundance of microbial communities at genus level

PY 和PVC 污染胁迫下，Acidobacteria（酸杆菌）、Betaproteobacteria（β-变形菌）、Nitrososphaera（亚硝化球菌属）、Gemmatimonas（芽单胞菌）、Gemmatirosa、Pyrinomonas、Acidobacteriaceae（酸杆菌科）、Cand_Candidatus_Entotheonella（棒状杆菌）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌）、Nitrospira（硝化螺旋菌）、Deltaproteobacteria（δ-变形菌）、Gammaproteobacteria（γ-变形菌）、Rhodoplanes（红游动菌属）、Acid_Candidatus_Koribacter（嗜酸菌）、Geobacter（杆菌）、Crenarchaeota（泉古菌）、Sorangium（纤维堆囊菌）、Pedosphaera、Bryobacter（苔藓杆菌）、Anaeromyxobacter（厌氧粘细菌）、Burkholderia（伯克霍尔德菌）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Myxococcus（粘球菌）、Flavisolibacter（黄色土源菌）、Edaphobacter（土壤杆菌）、Paenibacillus（类芽孢杆菌）、Chloracidobacterium等菌属的相对丰度低于CK，说明PY 和PVC 对这些菌属产生抑制作用。PY 和PVC 可增强Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌）、Nocardioides（诺卡氏菌）、Lysobacter（溶杆菌属）、Chlorof lexi（绿弯菌门）、Marmoricola（火山岩海球菌）、Streptomyces（链霉菌）、Phycicoccus、Solirubrobacter（土壤红杆菌属）、Conexibacter（束缚菌属）、Methylibium、Gaiella、Mesorhizobium（根瘤菌属）、Mycobacterium（分枝杆菌）、Sphingopyxis（鞘脂单胞菌属）、Sphingobium（鞘脂菌属）、Novosphingobium（新鞘脂菌属）、Variovorax（贪噬菌属）、Luteimonas（藤黄单胞菌）等菌属的相对丰度。

2.2 聚氯乙烯/芘存在下土壤中微生物菌群的功能预测

2.2.1土壤中微生物群落的生物学功能分析 根据GO 数据库，对CK、PY、PVC 和PY-PVC 土壤中微生物的生物学功能进行分析，结果见图2。土壤中添加PY 和PVC 后，Binding（结合）、Biological regulation（生物调节）、Cell（细胞）、Developmental process（发育过 程）、Enzyme regulator activity（酶活性调节）、Locomotion（运动）、Macromolecular complex（大分子复合物）、Metabolic process（代谢过程）、Molecular function regulator（分子功能调节）、Organelle（细胞器）、Reproduction（繁殖）、Structural molecule activity（结构分子活性）和Transporter activity（转运活性）功能的丰度呈升高趋势。但Biological adhesion（生物附着）、Cellular process（细胞进程）、Electron carrier activity（电子载体）、Extracellular matrix（细胞外基质）、Membrane（细胞膜）、Molecular transducer activity（分子传感器活性）、Response to stimulus（刺激反应）和Signaling（信号）功能的丰度降低。

图2 基于GO 的微生物群落主要功能分类Fig.2 Functional classification of microbial communities based on GO

2.2.2KEGG 代谢途径差异分析 从图3 可以看出，PY 和PVC 参与到Aging（衰老）、Amino acid metabolism（氨基酸代谢）、Biosynthesis of other secondary metabolites（次级代谢产物合成）、Cell growth and death（细胞生长和死亡）、Cell motility（细胞运动）、Cellular community（细胞群落）、Circulatory system（循环系统）、Energy metabolism（能量代谢）、Environmental adaptation（环境适应）、Excretory system（排泄系统）、Folding sorting and degradation（折叠分选与降解）、Lipid metabolism（脂类代谢）、Membrane transport（细胞膜转运）、Metabolism of cofactors and vitamins（辅助因子和维生素代谢）、Metabolism of terpenoids and polyketides（萜类和聚酮类代谢）、Nucleotide metabolism（核苷酸代谢）、Replication and repair（复制和修复）、Signal transduction（信号转导）、Transcription（转 录）、Translation（翻 译）、Transport and catabolism（转运和分解代谢）和Xenobiotics biodegradation and metabolism（外源化学物的生物降解和代谢）等代谢通路的比例都呈现升高趋势。

图3 基于KEGG 的代谢通路分析Fig.3 Metabolic pathway analysis based on KEGG

2.2.3碳水化合物活性酶（CAZy）分析 将基因序列输入CAZy 数据库进行比对，得到碳水化合物活性酶的注释信息，包括辅助氧化还原酶(AAs)、碳水化合物结合结构域（CBM）、碳水化合物酯酶（CEs）、糖苷水解酶类（GHs）、糖基转移酶（GTs）和多糖裂解酶（PLs），见图4。

图4 碳水化合物活性酶的分类统计Fig.4 Classification and statistics of carbohydrate active enzymes

3 讨论

酸杆菌作为土壤环境pH 的调节者，在维持土壤微生物群落的组成和稳定方面具有重要作用，可以参与反硝化作用，与土壤中的氮素循环相关，参与磷转化并可保持土壤中有效磷的含量［14-16］。变形菌具有固氮作用，是氨氧化作用的重要参与者，从而影响土壤中的氮素转化，能增强养分恢复和能量的产生［17-18］。芽单胞菌的相对丰度与土壤的理化特性（pH、总氮、速效磷和溶解性有机碳）和酶活性（过氧化氢酶、锰过氧化物酶、脲酶和过氧化物酶）显著相关，参与了碳氮循环和磷转化。一些前人研究也得出了与本研究结果相似的规律，例如，Hou 等［19］研究发现，添加PE 和PVC 微塑料后，土壤中酸杆菌科的相对丰度显著降低。酸杆菌、变形菌门和芽单胞菌门在地膜微塑料污染土壤中的相对丰度要低于对照组土壤［16］。亚硝化球菌属和硝化螺旋菌可能是酸土壤硝化作用的重要驱动者，在氮循环中起到重要作用［20-21］。Treusch 等［22］和Venter 等［23］利用环境基因组学方法研究发现泉古菌中含有氨氧化关键功能基因（amoA）。伯克霍尔德菌是在农田土壤中常见的一种解磷菌，可水解有机磷转化为无机磷酸盐，供环境中的生物利用［24］。厌氧粘细菌具有很好的聚磷效果［25］；假单胞菌进行硝化和反硝化的能力很强［26］。本研究中，在土壤中添加PY 和PVC 后，上述这些菌属的相对丰度均降低，说明PY-PVC 污染可能会通过抑制这些微生物的生长和繁殖过程来影响它们在氮磷循环和转化过程中的作用，从而降低了土壤中氮和磷的含量。通过测定PY 和PVC 存在下土壤中速效氮和有效磷的含量发现，与CK相比，添加PY-PVC 后速效氮和有效磷分别降低了10.81%和9.34%。

鞘氨醇单胞菌能够降解PAHs 和塑料单体，还可分泌多聚糖来促进塑料表面生物膜的形成［27］；鞘脂菌属和新鞘脂菌属可以降解菲和芘［28-29］，它们还被报道具有很强的降解塑料聚合物（聚乙烯醇）的能力［30］，并在PE、PP 和PS 微塑料表面的生物膜中检测到［31］，推测鞘脂菌属和新鞘脂菌属也具有降解微塑料的潜力。分枝杆菌、诺卡氏菌、溶杆菌属、火山岩海球菌、链霉菌、贪噬菌属和藤黄单胞菌均已被证实具有降解PAHs 的能力［32-37］。冯静［38］利用基因克隆技术研究发现，白浅灰链霉菌可以降解PE 塑料，其分泌的漆酶在降解过程中起到关键作用。这表明土壤中的微生物在受到PY 和PVC 污染的长期胁迫后，通过增加这些可耐受和降解PY 和PVC的菌群数量和组成来抵抗胁迫，使土壤生态系统在污染物作用下能够保持相对稳定。

生物调节是生物体通过自身调整和机制来应对污染胁迫的重要功能［39］；运动功能可以让生物体在污染环境中更好地生存下来［40］，PY 和PVC 的添加增强了土壤菌群的生物调节和运动功能，说明微生物能进行自调控来提高对PY-PVC污染的耐受性。发育、繁殖和代谢过程的增强会促进土壤微生物的生命活动而对PY-PVC 污染呈现出较好的适应能力。转运功能的增强可以让进入到细胞质内的污染物更好地排出到胞外，降低PY 和PVC 对微生物的危害。

氨基酸/碳水化合物/脂类代谢是生物体内的主要代谢途径，它们与能量代谢密切相关。核苷酸代谢与细胞自身稳态直接相关，这对于生物体的生理过程至关重要，有助于能量供给体腺苷三磷酸（ATP）和鸟嘌呤核苷三磷酸（GTP）的生成。次级代谢产物的合成可以进一步将微生物代谢过程产生的有害物质进一步转化，可以对抗生物进程中出现的氧化应激反应，提高微生物的存活能力［41］。PY 和PVC 的添加不仅增强了氨基酸/碳水化合物/脂类代谢等初级代谢进程，还促进了次级代谢产物的合成过程，包括萜类和聚酮类代谢、辅助因子和维生素代谢等，这说明土壤中微生物通过加快代谢过程，为微生物细胞的生命活动提供能量；还可通过提高自身的抗氧化能力来应对PY-PVC 污染的胁迫。转录是在RNA 聚合酶的催化作用下以DNA 的一条链为模板合成信使RNA（mRNA）的过程，然后在酶和辅助因子的协助下以mRNA 为模板合成蛋白质从而完成翻译过程，在微生物体内转录和翻译是同时发生的，通过调整基因的表达来适应环境的变化。信号转导是生物细胞针对外界环境变化所进行的生理应答反应，可通过改变细菌的基因转录表达来减轻环境胁迫的影响［42-43］。这些代谢途径比例的增加可能是微生物为了适应PY 和PVC 污染的调控机制。外源化学物的生物降解和代谢途径是将有污染物通过微生物的分解作用转化为小分子物质、CO2和H2O 的过程；细胞内积累的有害代谢产物可以通过细胞膜转运和排泄过程及时从体内排出，有利于微生物的生长，从而加速微生物群落的演替，提高微生物对PY、PVC 的解毒和抵抗能力。

AAs 属于催化蛋白质类，包括单加氧酶、过氧化物酶和氧化还原酶类等，它们在微生物降解有机污染物和塑料的过程中起到一定作用［44-45］。例如，细菌可以分泌不同的过氧化物酶进而控制其对芳香族化合物的降解作用；氧化还原酶会参与到有机污染物的降解过程中，并可维持细胞内环境的稳定；微生物群落可通过氧化还原酶类等参与其代谢途径来完成对污染物的分解。PY 和PVC 污染土壤中AAs 功能的增强，说明在两者的长期作用下，土壤中微生物表现出对PY 和PVC的降解潜力，这可能也是菌群抵抗污染物毒性的机制之一。CBM 是一个连续的氨基酸序列，可以通过非共价键作用方式将多糖底物断裂开［46］，CEs、GHs、GTs 和PLs 与多糖（木质素、木聚糖、多糖、纤维和半纤维等）的分解有关。胞外多糖的含量与微生物对污染胁迫的抵抗性呈正相关［47-48］，本研究在污染体系中与多糖分解相关酶的比例降低，说明PY 和PVC 的存在会抑制多糖的分解转化，促使微生物能更好地适应污染胁迫的环境。

综上所述，PVC-PY 复合污染会对土壤微生物群落的生物学功能、代谢途径和CAZy 酶活性产生一定影响，三者的变化具有一定的相关性。细胞膜转运和排泄过程的提高可以促进有害代谢产物排出到细胞外，这与菌群的转运功能的增强一致。菌群代谢功能的加快可为微生物细胞的生命活动提供充足的能量，这与其发育和繁殖功能的增强规律相符合。AAs 在有机污染物和塑料的微生物降解过程中发挥一定作用，AAs 活性的增强说明了在PVC-PY 污染土壤中微生物对两者的降解潜力，这与外源化学物的生物降解/代谢途径比例升高有很大的关联性。生物学功能、代谢途径和CAZy 酶活性对菌群的生物学过程具有相互联系的调控机理，对微生物群落应对PVC-PY污染的胁迫起协同作用，使土壤生态系统在污染物作用下能够维持相对稳定的状态。

4 结论

PY 和PVC 的添加会使β-变形菌、芽单胞菌、亚硝化球菌和伯克霍尔德菌等相对丰度降低，可能会抑制这些菌在氮磷循环和转化中的作用；增加了可耐受/降解PY 和PVC 的鞘氨醇单胞菌、诺卡氏菌、溶杆菌属、链霉菌和分枝杆菌等的相对丰度。PY和PVC能够增强土壤中微生物的发育、繁殖和自我调节功能，加快污染物的代谢进程和对有害产物的转运/排泄过程，不仅为生物体的生命活动提供能量，还可提高其自身的抗氧化能力，促使微生物对PY 和PVC 污染环境具有更好的适应能力。