不同浓度新型分裂素PBU诱导的尾巨桉愈伤组织中miRNA396及CKX基因表达差异研究

刘亚梅 吴宇朋 李莉梅 苏 敏 余 珠 欧阳乐军*

（1. 喀什大学生命与地理科学学院，叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，喀什 844000；2. 广东石油化工学院生物与食品工程学院，茂名 525000）

桉树是世界上公认的三大人工林树种之一，在全球各地的种类已达到1 000多种。桉树不仅在环境绿化、生态保护等方面起着重要作用，还广泛应用于制浆造纸行业，也可作为实木用材，叶片还可用于提炼桉叶油，在化工生产方面也有着重要作用。中国是目前世界上种植桉树面积第三的国家，其木材产量占全国木材总产量的30%左右，大大缓解了我国对天然林保护的压力。尾巨桉（）是尾叶桉和巨桉的杂交种，具有良好的杂交优势，是综合性比其他桉树品种更好的速生树种。因桉树种子高度杂合，其种苗生产一直是通过植物组培技术进行，但普遍存在不定芽分化效率不理想，再生效率低等问题。由于桉树的遗传背景较为复杂，遗传机理尚未明确，大多数性状属于多基因调控，常规育种手段已经无法满足培育不同用途的桉树优良品种的需求，利用基因工程技术进行遗传改良具有十分广阔的应用前景。

建立尾巨桉高效的离体再生体系是开展基因工程育种的前提，因此，尾巨桉愈伤组织诱导及不定芽分化机理的研究受到广大研究工作者的高度重视。尾巨桉离体再生过程受到多方面因素的影响，其中内源激素的调控尤为重要，如细胞分裂素与生长素等。尾巨桉愈伤组织的内源激素受miRNA所调控，miRNA396便是其中一种与尾巨桉愈伤组织内源分裂素含量紧密相关的miRNA，从而调控愈伤组织的分化与不定芽的发生。最近几年关于miRNA396基因家族的研究表明，在拟南芥中的miRNA396 有miRNA396A 和miRNA396B两个基因，靶向7 个生长调节因子（Growth-Regulating Factor，），根据miRBase 上登录的miRNA396 及其基因家族的研究进展来看，miRNA396是一条相当保守的miRNA，仅存在于36 个物种之中。在 水 稻 中，miRNA396 由8 个 基 因 编 码（miRNA396A～H），可以影响水稻的籽粒发育与抗旱能力等。大豆根系能否正常发育已被证实与9 个miRNA396 及其23 个靶基因（）所构成的调控网络有重要关系。根据公布的巨桉基因组比对分析，尾巨桉中miRNA396 家族有miRNA396A、miRNA396B，负责调控尾巨桉愈伤组织中的细胞分裂素氧化酶基因（Cytokinin oxidase gene，）与生长调节基因，从而参与尾巨桉愈伤组织内源激素对其生长分化的调控。细胞分裂素几乎参与了植物生长发育的全部过程，特别是细胞的分裂与分化的过程，而基因可以有效地调节植物组织中细胞分裂素的水平，进而参与了调控植物的生长发育过程。据研究，miRNA396通过调控其靶基因来影响植物的生根、发芽、开花和结果等生物学过程，也能控制植物体内细胞的代谢与植物对胁迫的反应。欧阳乐军等前期研究中发现新型分裂素PBU 对尾巨桉再生具有重要的调控作用。因此，研究不同浓度的PBU 处理下，尾巨桉愈伤组织miRNA396及基因表达差异，对研究尾巨桉高效再生体系建立有重要意义。

本研究以尾巨桉的无性系无菌苗的茎段作为外植体，以MS 作为基本培养基，添加琼脂、蔗糖，并用自主合成的高活性噻唑基脲类新型植物生长调节剂PBU（专利号：ZL200510035860.X）结合IAA 诱导愈伤组织，选取不同浓度PBU 处理的桉树愈伤组织样品，提取总RNA，反转录得到cDNA，利用实时荧光定量PCR，分析了基因家族和miRNA396A、miRNA396B 在尾巨桉不同愈伤组织中的表达差异，初步分析miRNA396和基因对尾巨桉内源激素的调控作用。本研究结果可为优化尾巨桉胚性愈伤组织诱导提供一定依据，为揭示尾巨桉胚性愈伤组织发生及分化的分子机制提供一定的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湛江市林业科学研究所提供的尾巨桉无菌苗为材料，切取无芽点的茎段分别接种在0.5（样品1）、1.0（样品2）、2.0（样品3）mg·L不同质量浓度的PBU 诱导愈伤组织，其他培养基组成为MS+0.05 mg·LIAA+100 mg·LVc，pH5.8～6.0，暗 培养2周后光培养1周，分别命名为样品1、2、3，作为后续试验材料。

1.2 主要试验试剂

异丙醇、Tris、EDTA、NaCl、SDS、焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）、无水乙醇、氯仿、Ms基盐、蔗糖、琼脂、Vc等购置于广州化学试剂厂，新型噻唑基脲类细胞分裂素（N-phenyl-·N′-［6-（2-chlorobenzothiazol）-yl］urea，PBU）由本实验室保存，Trans Zol Up Plus RNA Kit总RNA提取试剂盒、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒、Perfect StartGreen荧光定量PCR SuperMix 荧光定量试剂盒购于全式金生物技术有限公司，TIANgel Midi Purification Kit 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物设计

利用Primer 5 软件设计鉴定及荧光定量PCR引物。以基因作为内参基因，引物序列见表1。引物合成由生工生物工程（广州）有限公司完成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence used in the expriment

1.4 试验方法

分 别 用Eu396A-F、Eu396B-F 和Eu396A-R、Eu396B-R 为上下游引物，以尾巨桉基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增，反应扩增程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃最终延伸3 min；4 ℃保存。将得到的PCR 产物用琼脂糖（1.5%）凝胶电泳进行验证并回收目的条带。

将回收纯化所得的PCR 产物送检测序，利用DNAMAN 软件对测序结果和miRNA396A、miRNA396B 进行比对，用Primer 5 软件设计荧光定量PCR引物。引物设计方法同1.3，引物合成序列见表1。

分别提取前述3 种不同试验处理得到的愈伤组织RNA，提取方法参照全式金生物技术有限公司Trans Zol Up Plus RNA Kit 总RNA 提取试剂盒，使用超微量分光光度计测定总RNA浓度。

使用全式金生物技术公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，将上述RNA 逆转录成cDNA，进行下一步的实验操作。

选用样品1 的cDNA 作为模板，进行荧光定量PCR 扩增。为研究内参基因与目的基因引物特异性，进行不同退火温度梯度的定量PCR 实验。分别设置为56、58、60 ℃，其他条件不变。荧光定量PCR 反应体系为：2×TransScript Tip Green 荧光定量PCR SuperMix 10.0 μL，正向、反向引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddHO 7.2 μL。反应程序：94 ℃30 s，94 ℃5 s，56 ℃/58 ℃/60 ℃15 s，72 ℃10 s，每个扩增40次循环，每一个温度做3个重复。

采用全式金生物技术公司Perfect StartGreen 荧光定量PCR SuperMix 荧光定量试剂盒，StepOne 实时荧光定量PCR 仪对尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 和基因的表达量进行检测。内参基因选用尾巨桉基因，采用三步法进行荧光定量PCR，分析在不同浓度PBU 诱导下得到的桉树愈伤组织中miRNA396 和基因的表达差异。数据使用2法计算分析。荧光定量PCR 的程序设置为94 ℃30 s，94 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃10 s，40 个循环。使用模板量为1 000 ng 反转录得到的cDNA 作为荧光定量PCR 的模板，每个样品做3个重复，反应体系同1.4.3。

2 结果与分析

2.1 miRNA396的PCR扩增结果

由图1 可见，miRNA396A 与miRNA396B 扩增条带很亮，说明扩增效率好，且两条目的条带的大小与预期相符；条带浓度好，经送样测序分析，结果比对见图2，与预期生信分析的尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 序列完全一致，图中个别碱基差异是由套峰所致。

图1 miRNA396A与miRNA396B扩增电泳图1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396BFig.1 Amplification electrophoresis of miRNA396A gene and miRNA396B gene 1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396B

图2 miRNA396A与miRNA396B序列比对图A.miRNA396A序列比对图；B.miRNA396B序列比对图Fig.2 Sequencing results of miRNA396A and miRNA396BA.miRNA396A sequence alignment diagram；B.miRNA396B sequence alignment diagram

在DNAMAN 软件中对比测序结果，选取miRNA396A 和miRNA396B 中一段连续200 bp 的碱基序列，以此序列设计荧光定量PCR的引物。

2.2 尾巨桉RNA提取结果

图3 为不同浓度细胞分裂素PBU 处理下的桉树愈伤组织诱导结果，不同浓度PBU 诱导得到的愈伤组织在形态大小上都表现出较大差异。在0.5 mg·L细胞分裂素PBU 处理下的桉树愈伤组织质地紧密，呈颗粒状，在1mg·LPBU 诱导的桉树愈伤组织质地疏松、较膨大，顶端呈黄白色，在2 mg·LPBU 处理下的桉树愈伤组织分裂呈规则分裂的形态，整体表现为绿色。

图3 不同浓度PBU诱导得到的桉树愈伤组织A.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBUFig.3 Eucalyptus callus induced by different concentrations of PBUA.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBU

图4 为不同浓度细胞分裂素PBU 处理下的桉树愈伤组织的RNA 提取电泳结果。可以看出3 个样品RNA 电泳图中18 与28 S 两条带清晰无降解，并且28 S 的亮度很亮，几乎是18 S 的两倍，说明提取的RNA 完整性较好。也没有杂带，说明RNA 提取过程中没有受到DNA的污染。符合后续逆转录与荧光定量PCR实验要求。

图4 不同样品的RNA提取结果M.Marker；1～3.样品1～3Fig.4 RNA extraction results of samplesM.Marker；1-3.Sample 1-3

使用超微量分光光度计所测得的RNA 浓度与OD/OD的值。3 份样品的浓度最低为206 ng·μL，最 高 为655 ng·μL，OD/OD值 都 在1.8～2.0，证明提取的RNA 污染较少，提取的RNA浓度和纯度均满足后续实验的要求。

2.3 扩增特异性分析

为了探究基因及目标基因的最适退火温度，本实验选用56、58 和60 ℃进行荧光定量PCR，对3 个温度的扩增曲线和熔解曲线的结果进行分析。现不同退火温度下的目标基因都呈现单峰，说明引物特异性较好，但是基因的熔解曲线在56 与60 ℃时均出现了杂峰，因此，后续基因表达分析采用58 ℃为退火温度。

2.4 基因表达测定结果

经StepOne Software v2.3软件分析miRNA 396的表达差异，根据所测得的样品CT值，代入2法的公式计算它们的相对表达量，并使用SPSS软件对基因表达差异结果进行差异显著性分析（检验），其结果见图5。

图5 不同浓度PBU诱导的愈伤组织中目标基因表达差异*表示不同浓度PBU诱导的愈伤组织基因表达量差异显著；**表示不同浓度PBU诱导的愈伤组织基因表达量差异极显著Fig.5 Different expression of target genes in callus induced by different concentrations of PBU* indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.05）；** indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.01）

与样1 相比较，miRNA396A 和miRNA396B 在样2 中表达量均下调，分别为样1 的0.003 4 和0.032 1 倍，显著性检验结果sig=0.000 3＜0.01 和sig=0.004 3＜0.01，说明差异极显著。而样3 的miRNA396A表达量下调为样1的0.326 4倍，sig=1.46×10＜0.01，差异达到极显著水平，miRNA396B表达量却上调为样1的1.149 3倍，sig=0.050 6＞0.05，差异不显著。3 个样品的扩增曲线都呈现出明显的增长期和平台期，且每个样品的3个重复性较好。

用同样方法对基因进行分析，其结果见图5。与样1 桉树愈伤组织基因表达量相比较，样2 的、和基因表达量下调，分别为样1 的0.169 7、0.168 8 和0.756 6 倍，sig=1.067 1×10、sig=0.006 3、sig=0.003 4，均小于0.01，证明差异均达到极显著水平，其他基因均上调。在上调的基因里，除基因表达量为样1的14.360 1倍，sig=0.000 3＜0.01，差异达到极显著性水平外，其他两个基因表达差异均不显著。同样对样3 的基因表达量进行分析。相较于样1，样3 的基因均上调，基因均下调，上调基因倍数对应为样品1 的1.161 8、4.316 4、14.562 0 倍，显著性检 验 结果sig=0.036 1、sig=0.002 3、sig=0.000 3，差异分别达到显著、极显著和极显著水平，下调基因倍数对应为样品1 的0.129 2、0.224 3和0.907 6 倍，sig=7.184 1E-09、sig=0.001 0、sig=0.000 4，均小于0.01，差异均达到极显著水平。

3 讨论

本 研 究 发 现，miRNA396A 与miRNA396B 在0.5 mg·LPBU 诱导下的桉树愈伤组织表达量最高，因为在低浓度范围内，随着细胞分裂素浓度升高，愈伤组织的生长代谢加快，在1.0 和2.0 mg·LPBU 处理下的桉树愈伤组织生长发育状况要好于用0.5 mg·LPBU 诱导的桉树愈伤组织。miRNA396通过作用其靶基因来形成调控植物组织生产发育的调控网络。在本研究中的3种样品中，2.0 mg·LPBU诱导的愈伤组织已出现芽点，生长状态最好。在生长发育状态更好的愈伤组织中，2 个基因的表达量都出现了下调，说明miRNA396A 与miRNA396B 负调控尾巨桉愈伤组织内源激素合成。细胞分裂素在高等植物中存在主要部位是细胞分裂活跃的器官和组织，CKX 是目前已知惟一的专一催化天然异戊烯类CK 及其核苷的不可逆降解的黄素酶，它的合成由基因表达调控。通过降解细胞分裂素，调控植物体内细胞分裂素平衡，进而调控植物的生长发育，同时与植物的抗逆性和产量有密切的联系。基因和基因在2.0 mg·LPBU 诱导下的桉树愈伤组织表达量最高，因为细胞分裂素氧化酶通过氧化细胞分裂素从而下调植物细胞内细胞分裂素含量，由于环境中的细胞分裂素浓度大大增加，为了使愈伤组织内的细胞分裂素水平达到稳定状态，降解掉多余的CK，和基因在转录成mRNA 时受到正向调控，促进了它们的表达。同时细胞分裂素的含量是促进愈伤组织芽分化的重要因素之一，样品3 的愈伤组织和样品1、2 在外观上已有明显区别，样品1、2 的愈伤组织整体呈红色，而样品3的愈伤组织呈大面积绿色，已经有分化出芽点的趋势，可见在小于2 mg·LPBU 浓度时，升高培养基中的PBU 浓度可促进芽的分化。

本研究通过探究miRNA396 在不同生长发育时期及在不同浓度细胞分裂素培养的尾巨桉愈伤组织表达效率差异，初步确立了miRNA396 在尾巨桉植物组织中的调控情况和基因的表达差异，为后续进行尾巨桉miRNA 调控网络的解析奠定了基础。在此基础，可继续进行基因的表达效率差异测定的研究，从而确立调控网络体系对尾巨桉愈伤组织诱导及不定芽分化的具体调控方法，进一步促进新型分裂素PBU 在尾巨桉高活性愈伤组织诱导及不定芽分化中的应用。基因具有的组织表达特异性，即使是在同一个进化分支上的基因表达模式也不尽相同，因此可以推测基因在进化过程中分化出了不同的功能。基因家族的不同成员在植物生长发育的不同阶段都在相应的组织部位中发挥着其特定的作用，但其具体作用还有待深入探究。miRNA396 在植物中的调控网络非常复杂，研究miRNA396 及其靶基因对植物组织生理分化等的影响具有重要意义。miRNA396 基因家族在多种植物中的调控网络正逐渐被解密，在尾巨桉中的表达与调控只是miRNA396 基因调控网络中极小的一部分。相信在未来，miRNA 在植物发育中的调控网络究会成为众多研究者所关注的热点。