类芽孢杆菌产脂环七肽的中试发酵参数优化

黄 升，陈 利，苏国旗，黄金秀,2*

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.农业农村部养猪科学重点实验室，重庆 402460）

低剂量抗生素曾广泛添加到饲料中用于促进动物生长并增强抗病能力，但抗生素的滥用导致细菌耐药性加剧。我国于2020 年12 月31 日全面禁止在动物饲料中添加促生长类抗生素。因此，寻找新型抗生素替代品成为当前研究的热点。类芽孢杆菌（）为革兰氏阳性菌，在自然界分布广泛，可以分泌多种环脂肽，如表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和丰源素（Fengycin）等。研究发现，环脂肽具有抗菌、抗病毒、免疫调节等功能，且不易产生耐药性，在养殖业、医药、食品等领域的应用潜力巨大。都海明等研究发现，添加4 000 U/kg 环脂肽（含表面活性素和丰源素）能抑制断奶仔猪肠道有害微生物生长，降低腹泻，改善生长性能。饲粮中添加50 mg/kg 表面活性素可提高吉富罗非鱼肠道脂肪酶活性，调节脂肪代谢酶水平或活性，进而促进生长。因此，环脂肽对养殖动物生长与代谢具有正面影响，作为饲用抗生素替代品具有广阔的应用前景。

野生型菌株合成的环脂肽产量非常低，通常需要优化发酵条件来改变菌株代谢方式，提高产量。陈杰等对海洋芽胞杆菌（）B-9987 产新型环脂肽Marinhysin A 的培养基进行优化，发现培养基中添加42 g/L 蔗糖和42.3 g/L 酵母粉，Marinhysin A 浓度最大可达182 mg/L，较之前提高了28.5%。Abdel-Mawgoud 等试验发现，NaNO是枯草芽孢杆菌（）BS5 产表面活性素的最佳氮源，且适宜添加量为5 g/L。然而，目前关于环脂肽发酵条件的研究集中在实验室摇瓶阶段，鲜有中试发酵阶段的报道。本实验室筛选到1 株产脂环七肽的类芽孢杆菌，脂环七肽为表面活性素类似物，具有较高的开发价值。为此，本试验在前期实验室发酵条件筛选的基础上，探究中试发酵件下发酵时间及豆粕、葡萄糖、无机盐的添加量对脂环七肽产量的影响，为脂环七肽产业化开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基 类芽孢杆菌由重庆市畜牧科学院筛选得到并保存。LB（Luria-Bertani）液体培养基（北京索莱宝科技有限公司）组成为10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、10 g/L 氯化钠，pH 调至7.0；在LB 液体培养基中加2.0 %琼脂配制成LB 固体培养基；种子罐培养基为2.5 kg 蛋白胨、1.25 kg 酵母粉、1.25 kg 氯化钠、0.75 kg 消泡剂，装罐量230 L。

1.2 主要试剂 豆粕购自荣昌县粮油工业公司；葡萄糖为化学纯，购自荣昌县粮油工业公司；碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锰均为化学纯，购自重庆渝西商贸有限公司；AT-320F 型消泡剂为南海大田化学有限公司产品。脂环七肽标准品由实验室从类芽孢杆菌发酵液中分离纯化获得，经高效液相色谱检测，纯度为99.5%。

1.3 主要仪器 Ulti-Mate 3000 型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）、安捷伦C18（4.6×250 mm）反相色谱柱（安捷伦科技中国有限公司）、LDZH-200KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、Milli-Q 型超纯水仪（默克有限公司）、10 t发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）等。

1.4 种子液制备

1.4.1 菌株活化 将保藏在甘油管内的原代菌种接种于LB 斜面活化培养基上，在37℃环境中培养24 h。

1.4.2 种子菌摇瓶培养 将斜面培养的单菌落接入灭菌的、装有50 mL LB 培养基的三角瓶中，在37 ℃、200 r/min 的摇床上培养16 h，得到一级种子液。

1.4.3 种子罐培养 种子罐内的培养基灭菌后，按照1%接种量将一级种子液接种到500 L 种子罐中，在罐温36.0～37.5 ℃、罐压0.05 Mpa、pH 6.65～8.55、转速100～160 r/min、溶氧30 % 左右、通风量13～20 m/h的发酵条件下培养22 h，得到二级种子液。

1.5 中试发酵与样品制备 按5 m装容量将发酵物料投放入10 t 罐体内，加水后用搅拌桨低速混合，再用121℃蒸汽中灭菌30 min。灭菌后，将二级发酵种子按1.5%接种量进行接种。其他发酵条件为罐压0.05 MPa、溶氧30 %左右、pH 6.65～7.55、通风量260～380 m/h、罐温36.8～37.5℃、转速100～180 r/min。终止发酵后，将菌液以3 500 r/min 离心30 min 后取上清液，经喷雾干燥获得含脂环七肽的中试样品。

1.6 脂环七肽产量检测 称量1 g 左右的中试样品，置于25 mL 容量瓶中，加适量的超纯水，用超声处理10～15 min 后定容至25 mL；再在8 000 r/min、4℃条件下离心10 min，得到的上清液用0.22 μm 水相滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测。记录样品液相色谱图中相应峰的保留时间和峰面积，并计算脂环七肽产量。计算公式：

脂环七肽产量（%）=[（样品峰面积-标准曲线线性方截距）/（线性方程斜率× 进样体积）]×（样品定容体积/样品重量）

1.7 中试发酵参数优化 中试样品制备同试验方法1.5，脂环七肽产量检测同试验方法1.6。

1.7.1 发酵时间的优化 试验设置22、24、26、30 h 4 个发酵时间，除发酵时间外的其他中试发酵参数均保持一致。

1.7.2 葡萄糖添加量的优化 试验设置的2 种葡萄糖添加量分别3.70、4.44 kg/m，除葡萄糖外的其他中试发酵参数均保持一致。

1.7.3 豆粕添加量的优化 在实验室前期培养基筛选的基础上，以豆粕为氮源，考察不同添加量对脂环七肽产量的影响。试验设置了46.3、55.6、64.8 kg/m3 种豆粕添加量，除豆粕外的其他中试发酵参数均保持一致。

1.7.4 无机盐添加量的优化 试验比较了2 种无机盐配方（表1）对脂环七肽产量的影响，除无机盐外的其他中试发酵参数均保持一致。

表1 无机盐配方

1.8 统计分析 采用SPSS 22.0 软件进行分析，采用One-Way ANOVA 方法对豆粕添加量和发酵时间的试验数据进行方差分析，对葡萄糖和无机盐添加量的试验数据进行检验，同时采用LSD 法进行多重比较。＜0.05表示差异显著，＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 发酵时间对脂环七肽产量的影响 由图1 可知，随着发酵时间的延长，中试样品的脂环七肽产量呈先上升后下降的变化趋势。当发酵时间为26 h 时，脂环七肽产量最高，为1.41%，高于发酵22 h 时的产量（＜0.05）；而当发酵时间延长至30 h 时，脂环七肽产量降低至1.26%。因此，中试发酵时间选择26 h 为宜，后续试验均采用26 h 发酵。

图1 发酵时间对脂环七肽产量的影响

2.2 葡萄糖添加量对脂环七肽产量的影响 由图2 可见，中试发酵基质中分别添加3.70、4.44 kg/m葡萄糖，脂环七肽产量分别为1.28%和1.33%（＞0.05）。从成本角度考虑，建议葡萄糖选择添加3.70 kg/m。

图2 葡萄糖添加量对脂环七肽产量的影响

2.3 豆粕添加量对脂环七肽产量的影响 由图3 可知，随着豆粕添加量的增加，中试样品的脂环七肽产量先升高后降低。当豆粕添加量为55.6 kg/m时，脂环七肽产量高达1.35%，高于其他两组（＜0.05），提示豆粕在中试发酵基质中的适宜添加量为55.6 kg/m。

图3 豆粕添加量对脂环七肽产量的影响

2.4 无机盐添加量对脂环七肽产量的影响 由图4 可见，无机盐按配方1 添加时中试样品的脂环七肽产量（1.42 %）较按配方2 添加时脂环七肽产量（1.64 %）提高了15.49%（＜0.05），表明适当增加中试发酵基质中的无机盐添加量能提高脂环七肽产量。

图4 无机盐添加量对脂环七肽产量的影响

3 讨 论

3.1 发酵时间对脂环七肽产量的影响 发酵时间是影响芽孢杆菌产生活性物质的重要因素。研究表明，芽孢杆菌在不同发酵时间所产生的环脂肽种类存在差异，在对数生长期向对数期的过渡阶段会产生大量的表面活性素，而在稳定期的初始阶段产生丰源素，在稳定期的后期则产生伊枯草菌素。因此，不同活性物质所需要的菌株发酵时间会不同。本试验发现，随着发酵时间的延长，中试样品的脂环七肽产量呈先上升后下降的变化趋势，发酵26 h 时脂环七肽产量达到最高值。秦楠等也发现，解淀粉芽孢杆菌HRH317 菌株的抑菌活性随发酵时间的延长出现先增强后减弱的变化趋势，当发酵时间为18 h 时，抑菌活性达到最大，推断该菌株在对数生长末期开始合成活性物质，而从稳定期至降速期，由于培养基营养逐渐耗尽，菌体数减少，合成活性物质的能力降低。

3.2 葡萄糖添加量对脂环七肽产量的影响 葡萄糖作为速效的碳源，能快速启动菌体生长，缩短菌株发酵周期，促进次级代谢产物的产生。张志焱等对1 株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌进行培养基筛选及发酵工艺优化，得出适宜碳源为葡萄糖，且当葡萄糖在50 g/L 时产生的抗菌肽效价达到最高，为3.64×10U/mL。但本试验发现，葡萄糖添加量对类芽孢杆菌产脂环七肽的能力没有显著影响，可能是因为在中试生产中菌株对葡萄糖的利用效率发生改变，或是本试验中葡萄糖添加量变化较小导致。

3.3 豆粕添加量对脂环七肽产量的影响 氮源是影响发酵菌株生物合成环脂肽的关键因素。乔俊卿等采用单因素试验设计优化工程菌株B9BD 发酵合成表面活性素的条件，最终确定以黄豆粉为主要氮源、辅助添加牛肉浸膏和硝酸铵为氮源。豆粕的粗蛋白质含量较高，通常为43%～46%，且氨基酸组成比例好，可以作为芽孢杆菌培养的优质氮源。在发酵过程中，豆粕可被菌株利用供能，并产生1,6-二磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖等多种代谢产物，这些产物会激活菌株ATP-依赖的蛋白激酶系统，进而直接或间接调控抗菌脂肽的合成路径。本试验也发现，豆粕添加量会显著影响中试发酵样品中的脂环七肽产量，当豆粕添加量由46.3 kg/m增加到55.6 kg/m时，脂环七肽产量提高了28.57%；而当豆粕添加量增至64.8 kg/m时，脂环七肽产量又出现明显下降，故中试发酵基质中的豆粕适宜添加量为55.6 kg/m。

3.4 无机盐添加量对脂环七肽产量的影响 无机盐是发酵培养基的重要组成成分。菌体内的各种酶促反应均需要镁、钙、钾等多种离子参与，并影响抗菌肽的合成。本试验结果表明，适当增加中试发酵基质中碳酸钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锰的添加量，可以显著提高脂环七肽产量。Abdel-Mawgoud 等试验结果也表明，培养基中添加0.16 g/L 硫酸锌、0.27 g/L氯化铁和0.017 g/L 硫酸锰，提高了枯草芽孢杆菌表达表面活性素的能力。

4 结 论

本研究结果表明，以脂环七肽产量为衡量指标，优化后的类芽孢杆菌中试发酵基质为55.6 kg/m豆粕、3.70 kg/m葡萄糖、3.33 kg/m碳酸钙、1.11 kg/m硫酸镁、1.11 kg/m磷酸氢二钾、1.11 kg/m磷酸二氢钾、0.22 kg/m硫酸锰，适宜发酵时间为26 h，脂环七肽产量从1.04 %提高到1.64 %，可为利用该菌株实现脂环七肽产业化生产提供参考。