鲁莱黑猪线粒体基因突变鉴别及其与生长和肉质性状的关联分析

2022-10-12张昌政郑仰清张廷荣周李生

中国畜牧杂志 2022年10期

徐晶，张昌政，郑仰清，张廷荣，周李生

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）是一种核外遗传物质，结构较为简单，分子量小，呈现严格的母系遗传。mtDNA 由编码区和非编码区（包括D-loop 区）组成，编码区编码参与氧化磷酸化和生成ATP 的多肽，非编码区包含复制起点以及转录启动子等，是重要的调控区域。mtDNA 突变可能诱发疾病或个体表型差异，对其遗传机制的解析具有一定的科学意义和实用价值。已有报道显示：在人类中，mtDNA 突变可能影响许多疾病，如癌症、糖尿病等；在畜禽中，发现mtDNA 突变与牛产犊率、肉质、牛奶品质性状、胚胎生产效率、体重、猪繁殖力存在显著关联。但mtDNA 突变与猪生长和肉质性状之间关系的研究却鲜有报道。

中国家猪资源丰富，品种繁多，大多数地方猪种都具有繁殖力高、抗逆性强等优异种质特质，尤其肉质品质显著优于国外品种。鲁莱黑猪作为具有代表性的中国培育新猪种，由我国莱芜猪（具有代表性的中国地方猪品种）与约克夏猪杂交培育形成，肉质优良并以其肌内脂肪含量高而闻名。因此本实验重点研究鲁莱黑猪mtDNA 中的突变位点与背膘厚度、背最长肌肌内脂肪含量和背最长肌肌肉水分含量的关联性，分析鲁莱黑猪mtDNA 的遗传效应，从而为鲁莱黑猪肉质和生长等性状的选育育种提供基础可靠的研究数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物本研究对象为433 头鲁莱黑猪，其中274 头公猪，159 头母猪。所有猪只均来源于莱芜猪原种猪场。用耳号钳采集耳组织样品，放置于装有75%酒精的离心管中，-20℃冻存，用于后续提取鲁莱黑猪基因组DNA。

1.2 实验分组为尽可能搜寻鲁莱黑猪群体中mtDNA的所有突变位点，本研究根据表型测定结果的差异，即背膘厚度（14.00～30.00 mm，30.00～45.00 mm，45.00～55.00 mm，＞55.00mm），背最长肌肌肉水分含量（54.00%～60.00%，60.00%～65.00%，65.00%～70.00%，70.00%～75.00%），肌内脂肪含量（1.00%～4.00%，5.00%～10.00%，11.00%～15.00%，15.00%～19.00%）将实验动物分为4 组，从每组中随机挑选4 个个体，进行2 个样本重复，共构建8 个DNA 混池。具体如表1所示。

表1 DNA 混池样品表

1.3 表型测定鲁莱黑猪体重达85 kg 左右时进行屠宰，屠宰后利用游标卡尺测量背中线肩部最厚处背膘厚（Backfat Thickness at the Shoulders，BFT_S）、胸腰椎结合处背膘厚（Backfat Thickness at Last Ribs，BFT_R）和腰荐椎结合处背膘厚（Backfat Thickness at the Loin，BFT_L）。取最后肋处背最长肌200 g 用于IMF和MMP 的测定。测定前，背最长肌需除去外周筋膜，用小型绞肉机搅碎放入65℃烘箱中烘干至恒重，根据烘干前后重量差占鲜重的百分比计算出水分含量。IMF含量采用索氏石油醚萃取法测定完成。

1.4 DNA 提取采用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/ 组织基因组DNA 提取试剂盒（TIANGEN 生化科技公司）提取耳组织基因组DNA。用SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度计对DNA 进行质量检测和浓度测定。A260/A280 比值在1.8～2.0、A260/A230 比值＞2.0 评定为合格的DNA。对合格的DNA 样品使用双蒸水（ddHO）统一稀释浓度至20～50 ng/µL，用于后续实验。

1.5 线粒体基因组测序参照NCBI 中猪线粒体基因组序列（Sscrofa11.1 NC 000845.1），利用Primer Premier 5.0软件设计引物，保证覆盖线粒体的全部序列。每对引物的下游引物保证覆盖下一对引物的上游引物并相距最少50 bp，扩增片段不超过1 000 bp 以保证测序的准确性，引物信息见表2。所有引物均由青岛擎科生物公司合成。PCR 反应体系：12.5 μL DreamTaqGreen PCR Master Mix（2X），8.5 μL ddHO，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL。PCR 扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳条件为180 V 35 min。将条带明亮且单一的PCR 产物原液送由青岛擎科生物公司Sanger 测序。如遇多拷贝序列，则正反向测序。

表2 鲁莱黑猪mtDNA 测序PCR 引物及反应条件

1.6 序列组装及突变位点搜寻和分析使用DNAMAN和Chromas 软件查看测序结果比对峰图，并且根据比对结果鉴定突变位点，获取鲁莱黑猪线粒体基因突变遗传信息。使用SeqMan 软件将35 对不同引物所测定的序列片段进行拼接，同时使用MEGA-X 软件对拼接完整的全部mtDNA 序列进行核对。利用Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和SIFT-Protein（http://sift.jcvi.org）对突变位点进行功能预测，筛选有效的突变位点。使用在线网站Ensembl 进一步查阅位点保守性，越保守的位点发生变异越有可能对功能和结构造成影响。根据突变位点的分析结果，将鲁莱黑猪所有的耳组织DNA 样品及筛选出的重要位点信息送至上海天昊生物科技有限公司进行SNaPshot 基因分型。

1.7 统计分析利用R 包PerformanceAnalytics 中的函数chart.Correlation 计算表型BFT_S、BFT_R、BFT_L、背最长肌肌肉水分含量以及肌内脂肪之间的相关显著性并用Performance Analytics 绘制图形进行数据可视化；使用PLINK 软件中的线性模型进行关联分析，将性别和体重作为固定效应，其表达式为：y=+Xb+SNP×+e。其中，y 为测定表型值，表示总体平均值，X 是固定效应的关联矩阵，b 是性别和体重的固定效应向量，为SNP 标记的效应，e 为残差。

2 结果

2.1 鲁莱黑猪表型测定结果的相关性分析该群体所测表型性状均符合正态分布，由图1 可见鲁莱黑猪表型性状之间的相关程度。肌内脂肪与背最长肌肌肉水分含量相关性最强，呈负相关，相关系数为-0.86；肌内脂肪与BFT_S、BFT_R、BFT_L 都存在较弱的相关性，相关系数分别为0.17、0.21、0.25；BFT_S、BFT_R、BFT_L 两两性状之间存在强的相关性，相关系数均大于0.6。除此之外，各性状之间影响都极显著（＜0.01）。

图1 鲁莱黑猪种群生长与肉质性状的表型相关系数

2.2 鲁莱黑猪线粒体基因组突变位点的鉴定与生物学信息分析

2.2.1 mtDNA 突变鉴定组装拼接得到8 条鲁莱黑猪的mtDNA 全序列，发现8 条mtDNA 序列的长度都约为16 750 kb。通过对随机挑选的16 头鲁莱黑猪耳组织DNA 样品测序结果进行比对，共在其线粒体基因组检测到11 个突变位点，其中D-loop 区含有2 个突变（mt_241:T/C、mt_387:A/G），多肽编码区9 个突变（mt_5351:A/T/ND2、mt_5666:T/C/ND2、mt_7992:A/G/COX1、mt_9130:A/G/ATP6、mt_9648:G/A/ATP6、mt_10537:T/C/COX3、mt_13751:G/A/ND5、mt_14326:T/C/ND5、mt_15141:A/G/ND6）。而12S rRNA、16S rRNA 以及tRNA 基因中未发现鲁莱黑猪线粒体突变，如图2 所示。

图2 鲁莱黑猪mtDMA 突变位点峰图

2.2.2 mtDNA 突变位点分析如表3 所示，在11 个突变位点中存在4 个错义突变，仅突变位点mt_9648 氨基酸极性发生变化，其余突变位点氨基酸性质没有改变。同时对11 个突变位点进行有害性预测及保守性分析。利用在线网站Ensembl 查阅突变位点的保守性，基于90 种哺乳动物物种的多序列比对得到了位点的保守性分值。结果表明，位点mt_9648 分值绝对值最低，相对于其他位点保守性最低；位点mt_10537、mt_13751 以及mt_15141 保守性分值绝对值最高，位点也相对保守。采用Polyphen2 和SIFT-Protein 方法分别预测到2 个（mt_9130、mt_13751）和1 个（mt_9648）有害突变位点，见表4。基于上述分析结果，mt_9130、mt_9648和mt_13751 3 个突变位点的多态性更容易对线粒体的结构和功能造成影响。

表3 鲁莱黑猪mtDNA 突变位点氨基酸分析

表4 鲁莱黑猪mtDNA 突变位点有害预测及保守分析

2.3 鲁莱黑猪mtDNA 功能突变位点与生长和肉质性状的关联分析通过位点有害性预测和保守性分析筛选出的3 个线粒体突变位点mt_9130、mt_9648、mt_13751与鲁莱黑猪的背膘厚度、肌内脂肪以及背最长肌肌肉水分含量进行关联分析，结果发现，mt_9130 和mt_9648 2 个突变位点均对鲁莱黑猪的肌内脂肪影响极显著，对背最长肌肌肉水分含量影响显著。mt_13751 突变位点在矫正性别与体重因素后，对BFT_R 影响显著。除此之外，发现mt_9130 与mt_9648 2 个突变位点之间对性状的影响效应总是连锁相同的（表5）。

表5 鲁莱黑猪mtDNA 突变位点与肉质性状关联分析

3 讨论

背膘厚度、背最长肌肌肉水分含量和肌内脂肪对猪的生长和肉质具有重要的经济意义，而其是否受mtDNA 的影响是一个值得关注研究的问题。先前mtDNA 被广泛报道与牛羊猪等动物的复杂性状相关，但在猪生长和肉质等方面的研究却是极少。此外已有研究表明，在人类疾病中，线粒体编码基因的突变会导致氧化磷酸化酶复合物的变化，因此可合理猜想线粒体DNA 对猪的经济性状有影响。本研究则以鲁莱黑猪为研究对象，探讨mtDNA 变异与背膘厚度、MMP 以及IMF 之间的关联。

母系遗传的线粒体基因是双链的，在猪中约为16.7 kb。本研究在鲁莱黑猪群体中测得其全长约为16 750 bp，跟报道相一致。本研究根据表型差异分组，从组别中随机挑选测序样本，随机性更强，范围更广，数据更加可靠。通过对鲁莱黑猪群体线粒体基因测序，发现存在11 个突变位点。其中多肽编码区存在9 个突变位点，D-loop 区存在2 个突变位点。D-loop 区的序列不编码蛋白，是mtDNA 的调控区域，且该区域的变异高于其他mtDNA 区域或核基因，已被广泛用于研究种群之间的关系。因此本研究重点探讨了多肽编码区突变位点对背膘厚度、背最长肌肌肉水分含量和肌内脂肪的影响。

本实验筛选出3 个突变位点（mt_9130、mt_9648、mt_13751）。mt_9130 与mt_9648 位于基因上游，mt_9130 同时位于基因末端。基因是ATP 合成酶F0 亚基6，基因是线粒体编码的ATP合酶膜亚基8，两者都是ATP 合成酶的重要亚基。ATP合酶在动物机体能量代谢中发挥重要作用，控制着ATP的合成，参与体内脂肪、蛋白质、糖等重要物质的代谢活动，当、基因上位点发生突变时会引起ATP 合成酶功能的改变。据Ensembl 网站报道记录，突变位点mt_9130 与mt_9648 可能与线粒体疾病以及线粒体DNA 缺失综合征相关，且在人类基因上已存在突变个体。突变位点mt_13751 位于ND5 基因中，是mtDNA 的一个蛋白编码基因，是NADH 脱氢酶的2 个亚基，而NADH 脱氢酶是呼吸链复合体I 的主要组成，在呼吸链中直接参与氢与电子传递并通过氧化磷酸化产生ATP，进而参与能量代谢。有研究证明了mtDNA上的基因在不同品种鸡中的异质性对脂肪性状和肉质性状产生显著关联，说明基因表达对脂肪性状具有一定影响，可能原因是NADH脱氢酶在能量代谢中脂肪转化过程的功能。

在混合线性模型分析中，不必要因素会干扰主要因素的估计。因此本研究的关联分析模型中矫正了性别跟体重，结果表明背膘厚度、MMP 以及IMF 都会收到相应突变位点遗传效应的影响。但位点mt_13751 仅对BFT_R 有显著影响，可能原因：一是不同组织部位线粒体基因表达存在差异性，二是不同部位mtDNA 存在异质性相关。根据研究结果，在今后鲁莱黑猪育种选育过程中，可以适当淘汰少数野生型个体猪，以mt_9130、mt_9648 以及 mt_13751 的突变猪个体为母本进行繁殖交配，改善提高种群的背膘厚度、背最长肌肌肉水分含量和肌内脂肪含量。综上所述，本研究结果证实了mtDNA 遗传变异对鲁莱黑猪重要经济性状存在遗传效应，并推动了对mtDNA 的进一步研究。