HPLC 同时测定茵栀黄颗粒及新生儿尿液中栀子苷和黄芩苷的含量
2022-10-11唐怡刘甜甜曾珊珊李健
唐怡，刘甜甜，曾珊珊，李健
1.江西省中西医结合医院，江西 南昌 330003；2.九江学院附属医院，江西 九江 332000
茵栀黄颗粒，是由茵陈、栀子、黄芩、金银花组成的方剂，临床多用于治疗新生儿生理性和病理性黄疸［1］。茵栀黄颗粒的用药对象多为新生儿，由于新生儿药物代谢能力差、药物排泄慢的特点［2］，所以对用药剂量的要求非常苛刻。茵栀黄颗粒药品说明书标注了成人用法用量，但新生儿的剂量较少涉及，使得新生儿用药剂量问题变得非常棘手。
《中国药典》2020 年版一部注明黄芩苷和栀子苷是茵栀黄颗粒重要的药效指标［1］，可用于评价茵栀黄颗粒的质量。黄芩苷水溶性差、口服生物利用度低，主要以代谢物黄芩苷的形式存在［3-6］。栀子苷在体内无明显蓄积现象［7-9］。黄芩苷和栀子苷主要以原形经尿液排出体外［9-10］。本研究的实验目的：（1）以栀子苷和黄芩苷为检测指标，测定现售的茵栀黄颗粒中的栀子苷和黄芩苷含量，考察是否符合《中国药典》2020 年版一部规定；（2）通过收集服药后不同时间段新生儿尿液，测定尿液中黄芩苷和栀子苷的含量，了解其药物排泄情况，从侧面了解茵栀黄颗粒在新生儿体内的代谢情况，为新生儿用药剂量提供参考。
1 实验材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪为Agilent 1260（Agilent 公司，美国）。色谱柱：XtimateTM C18（4.6 mm×200 mm，5 μm)。KQ-400DE 型超声波清洗器（超声电功率：150 W；工作频率：40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（BS110S，北京赛多利斯仪器有限公司）。
1.2 试药
栀子苷对照品购自中国食品药品检定研究院（批号110749-201718，纯度98.70%）；黄芩苷对照品（批号 RP190624，纯度99.1%），购自成都麦德生科技有限公司。甲酸、乙腈为色谱纯（Tidea 公司，美国）。甲醇为分析纯（西陇化工股份有限公司）、蒸馏水（自制）。茵栀黄颗粒，购自山东鲁南厚普制药有限公司，批号：09210232、09210911。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件
流动相为乙腈（A）—0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱，程序为0～5 min，15%→20%A；5～20 min，20%→40%A；20～40 min，40%→55%A；40～45 min，55%→40%A；45～55 min，40%→15%A。流速为1.0 mL/min，柱温35 ℃。进样量10 μL，色谱图见图1。
图1 茵栀黄颗粒相关的高效液相色谱图
2.2 对照品溶液的制备
精密称取栀子苷和黄芩苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为36.98 μg/mL 和798.11 μg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取茵栀黄颗粒0.2 g，置 50 mL 容量瓶中，加 50% 甲醇约40 mL，超声提取（150 W，40 kHz）30 min，放冷至室温后，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。
尿液预处理：征集10 名新生儿黄疸患者（5 名男婴，5 名女婴）服用茵栀黄溶液，采用新生儿尿袋收集服药0、2、4、6、8、10 h 的尿液，取5 mL于具塞离心管中，4 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，待用。
新生儿用药剂量：运用公式小儿剂量（g）=成人剂量（g）×小儿体重（kg）/70，成人剂量为每次6 g，新生儿体重按3 kg 计算，计算结果约为0.2 g。即患儿口服给药每次0.2 g。
2.4 阴性样品制备
按照茵栀黄颗粒的处方比例，分别制备缺栀子和黄芩的阴性制剂，并按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.5 线性关系考察
取栀子苷和黄芩苷对照品溶液，分别稀释1、2、5、10、20、50、100 倍，进样10 μL，记录峰面积。以栀子苷浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得到标准曲线Y=13.628X+3.069 4，r=0.999 8。以黄芩苷浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得到标准曲线Y=1.508 8X-1.78，r=0.999 9。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液，连续进样6 次，依次测定，记录峰面积，栀子苷的RSD值为1.78%，黄芩苷的RSD 为0.91%。
2.7 重复性试验
精密称取茵栀黄颗粒0.2 g，共6 份；按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依次测定，测得栀子苷质量分数的RSD 为1.72%，黄芩苷的RSD 为1.51%。
2.8 稳定性试验
精密称取茵栀黄颗粒0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件间隔2 h 进行测定一次直至24 h，记录峰面积，栀子苷质量分数的RSD 为2.14%，黄芩苷的RSD 为1.77%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
取批号为09210232 的茵栀黄颗粒0.1 g，6 份；各精密加入 含20.01 μg/mL 栀子苷和696.5 μg/mL黄芩苷对照品溶液 10 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。依次测定，结果见表1。经计算，栀子苷的回收率平均值为99.98%，RSD 值为0.83%，黄芩苷的回收率平均值为99.39%，RSD 值为0.71%，表明该方法的准确度良好。
表1 栀子苷和黄芩苷的加样回收率
2.10 样品含量测定
取0.2 g 不同批号的茵栀黄颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行6 份，用外标法计算，结果如表2 所示，均符合《中国药典》2015 年版一部规定［本品每袋含栀子提取物以栀子苷（C17H24O10）计，不得少于3.0 mg。本品每袋含黄芩提取物以黄芩苷（C21H18O11）计，应为180～220 mg。茵栀黄颗粒要求每袋3 g 装的栀子苷含量不得低于3 mg，黄芩苷含量180～220 mg］。另称取10 份0.2 g 批号为09210232 的茵栀黄颗粒给予10 名患有新生儿黄疸症的新生儿服用，采用新生儿尿袋收集服药0、2、4、6、8、10 h 的尿液。12 h 时，用三氯化铁试剂检测尿液中有无黄芩苷、氨基酸试剂检测有无栀子苷，结果均为阴性，说明12 h 时栀子苷和黄芩苷代谢完毕。次日，再选用批号为09210911 的茵栀黄颗粒，同法操作。10 名新生儿不同时间段尿液中栀子苷和黄芩苷的平均值含量见表3。
表2 茵栀黄颗粒栀子苷和黄芩苷的含量（n=6）
表3 不同时间尿液中的栀子苷和黄芩苷含量 mg
3 讨论
3.1 波长的选择
药典中规定栀子苷的检测波长为238 nm，黄芩苷的检测波长为280 nm。试验了2 个波长，发现波长238 nm 时，可以同时灵敏地检测到栀子苷和黄芩苷的色谱峰，所以选择238 nm 为测定波长。提高了实验的灵敏度，缩短了检测时间。
3.2 尿液中栀子苷和黄芩苷的变化
由表3 可知，尿液中检测的栀子苷和黄芩苷的含量均呈现先增加后减少的趋势，尿液中药物浓度在用药0～6 h 左右较高，用药10 h 后大幅减少。这与文献栀子苷和黄芩苷的代谢结果一致［4-10］。12 h内，栀子苷和黄芩苷的累计排泄分数分别为20.04%和16.40%，提示栀子苷和黄芩苷以原形从肾脏清除是其主要排泄途径。另从结果中不难发现栀子苷和黄芩苷在体内留存时间不长，与结构不稳定，苷键易水解有关。
3.3 栀子苷和黄芩苷的肝肾毒性
一定剂量的黄芩苷和栀子苷具有肝肾毒性［11-12］。吴斌等［3］发现黄芩苷在体内有累积作用，口服3 h 后在肝肾浓度最高［3,5］。本实验测得茵栀黄颗粒的栀子苷和黄芩苷含量分别为2.002 mg/g 和69.52 mg/g，含量很低。其中，栀子苷远远低于300 mg/kg的肾脏受损的最低浓度［6］。新生儿服用茵栀黄颗粒后，尿液中检测的栀子苷和黄芩苷的含量均呈现先增加后减少的趋势。栀子苷和黄芩苷以原形从肾脏清除是其主要排泄途径。栀子苷和黄芩苷在体内留存时间不长。综上，0.2 g 的茵栀黄颗粒，对于新生儿而言，是安全剂量。
