21种大眼蟹线粒体COI基因比较及系统进化分析

2022-10-11孟磊张莹张旭龚理韦信贤童桂香高阳

南方农业学报 2022年7期

孟磊，张莹，张旭，龚理，韦信贤，童桂香，高阳

（1浙江海洋大学水产学院/水产动物遗传与发育实验室，浙江舟山316022；2浙江海洋大学海洋科学与技术学院/海洋生物种质发掘与利用国家地方联合实验室，浙江舟山 316022；3中国科学院动物研究所/动物系统与进化重点实验室，北京 100101；4广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021）

0 引言

【研究意义】线粒体基因组结构简单，呈母性遗传，且具有拷贝数多、进化速度快及不同区域进化速率各异等特点，已成为群体遗传学和分子系统学领域研究的重要分子标记（Miya et al.，2001；Campbell et al.，2014；Tan et al.，2019）。在线粒体众多基因片段中，细胞色素氧化酶I亚基（Cytochrome oxidase subunit I，）具有进化速率适中且易于扩增的特点，自21世纪初Tautz等（2002）提出将DNA片段应用于物种分类及Hebert等（2003a，2003b）提出DNA条形码概念以来，线粒体基因受到分类学、生态学、保护生物学和进化生物学等生物领域的广泛关注（吉鹏宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗宪广等，2013）。因此，建立DNA条形码数据库对解决物种鉴定及系统亲缘关系研究等具有重要意义。【前人研究进展】吉鹏宇等（2008）基于线粒体基因和16S rRNA部分序列对福建、东山等6个拟穴青蟹（）野生群体的遗传结构进行分析，结果表明不同拟穴青蟹野生群体的遗传背景基本相似，群体间存在着明显的基因交流。葛家春等（2011）以同样方法分析中华绒螯蟹（）群体遗传结构，结果显示不同水系中华绒螯蟹群体已不能形成明显的地理群体结构，即中华绒螯蟹存在明显的种质混杂现象。苗宪广等（2013）以线粒体基因为分子标记，对鲽形目舌鳎亚科（Cynoglossinae）28种鱼类进行系统发育研究，结果发现所有舌鳎亚科鱼类形成一个单系群，与无线鳎亚科（Symphurinae）鱼类形成稳定的姐妹群关系；此外，遗传距离结果支持长吻红舌鳎（）和紫斑舌鳎（）分别与短吻红舌鳎（）和短吻三线舌鳎（）是同物异名关系。缪晓翔等（2017）利用线粒体基因序列对泰国近海的69个有毒水母样本进行遗传多样性分析，结果发现这些样品可以分为13个种，包括5种钵水母、6种立方水母和2种水螅水母，其中Carukiidae存在新属新种，进一步证实基因片段能快速有效区分这些有毒水母种类；类似结果在Ortman等（2010）、李玉龙等（2017）对水母物种多样性及系统发育研究中也得到验证。随着测序技术的快速发展，线粒体基因序列作为物种鉴定的分子条形码已被广泛接受；截至2021年1月，国际生命条形码计划（iBOL）数据库中已收录900万余条基因序列，而形态鉴定辅以分子条形码技术是解决物种分类鉴定困难的有效途径之一（杜鹤等，2011；周晓梦等，2017；唐富江等，2020；熊娟等，2020）。【本研究切入点】大眼蟹隶属于十足目（Decapoda）短尾次目（Brachyuran）沙蟹总科（Ocypodoidea）大眼蟹科（Macrophthalmidae），广泛分布于印度—西太平洋中低潮间带的泥滩与岩礁地区，甚至包括亚潮带区域（戴爱云等，1986）。早期研究认为，大眼蟹隶属于沙蟹科（Ocypodidae）大眼蟹亚科（Macrophthalminae），但近期的形态学和分子鉴定结果均支持将其提升为科级水平（毛开云，2010；Chen et al.，2018；Wang et al.，2020）。据WoRMS（http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=439151&allchildren=1）记载，大眼蟹科包括3亚科13属131种，当前大部分研究聚焦于形态结构和生态习性等方面（Naderloo，2011，2012），而少有研究关注该科种类在分子水平上的差异及种间亲缘关系（徐敬明，2009，2010）。【拟解决的关键问题】通过测定同属3种大眼蟹［拉氏大眼蟹（）、日本大眼蟹（）和太平大眼蟹（）］的线粒体基因序列，结合GenBank已公布的18种大眼蟹科基因部分序列，对21种大眼蟹的线粒体基因序列进行比较分析，探究基因作为大眼蟹科物种鉴定分子标记的可行性；同时基于基因序列构建目前最全面的大眼蟹科系统发育树，以期为大眼蟹科系统发育研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组提取

拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹分别采集于海南陵水海鲜市场、浙江台州礁山码头和广东广州南沙港，每种大眼蟹各取1只。新鲜标本以酒精固定后运回实验室，经形态学鉴定后用95%酒精保存。分别取蟹类螯足肌肉组织约30 mg，剪碎放入离心管中，采用海洋动物基因组织提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因组DNA，以紫外分光光度计检测其质量与浓度，并稀释为50 ng/μL，-20℃冰箱保存备用。

1.2 引物设计与PCR扩增

基于短尾次目线粒体基因全序列，在其保守区域设计用于扩增3种大眼蟹基因全序列的通用引物F1-COI（5'-CYGCCTTATTCATCTAYGC RAGA-3'）/R1-COI（5'-TANACYTCWGGRTGHCCR AARAAYCA-3'）和F2-COI（5'-TCNACAAAYCATAA AGAYATYGG-3'）/R2-COI（5'-TARCGGTTGATHAR GAGT-3'）。PCR反应体系44.0μL：Mix酶20.0μL，上、下游引物各2.0μL，DNA模板2.0μL，ddHO补足至44.0μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃30 s，48～54℃50 s，68℃1～3 min，进行35个循环；68℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，将阳性PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.3 序列拼接、注释及分析

测序结果采用Codoncode Aligner 5.1.5（Codon-Code Corporation，Dedham，MA）进行拼接，并辅以手工校对；利用Sequin v15.10（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/）对线粒体基因全序列进行注释，运用ClustalX 2.0进行序列比对（Larkin et al.，2007），使用MEGA X计算基因组碱基组成、保守位点和遗传距离（Kumar et al.，2018），并以MatGAT 2.02进行多序列比对分析（Campanella et al.，2003）。

1.4 系统进化树构建

以三疣梭子蟹（）和红星梭子蟹（）为外类群，从GenBank下载18种大眼蟹科线粒体基因部分核苷酸序列（表1），结合本研究测定的3种大眼蟹基因序列，采用MEGA X中的最大似然法（Maximum likelihood，ML）和最大简约法（Maximum parsimony，MP）分别构建系统发育进化树（Kumar et al.，2018），设自展值（Bootstrap）为1000次，探究大眼蟹科系统进化关系。

表1 构建系统发育进化树所用的参考物种信息Table 1 Reference species information for phylogenetic tree

2 结果与分析

2.1 3种大眼蟹COI基因全序列比较分析结果

测序获得的拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹线粒体基因全序列提交至GenBank，登录号分别为MW423579、MW425691和MW425694。三者全长均为1534 bp，编码511个氨基酸残基，均以ATG作为起始密码子及T作为不完全终止密码子。3种大眼蟹基因的碱基含量差异不明显，4种碱基平均组成分别为32.1% T、24.5% C、28.0% A和15.4% G。核苷酸序列比对分析发现，共有1175个保守位点及359个变异位点（约占23.4%），其中绝大多数变异位点出现在第3位密码子（313个变异位点），第1位密码子存在43个变异位点，第2位密码子非常保守，仅有3个变异位点（图1-A）；基因整条序列均为连续编码，不存在碱基插入或缺失现象。将核苷酸序列翻译成氨基酸序列再进行比对，结果仅发现16个变异位点，变异位点率为3.1%（图1-B），说明基因第3位密码子变异并不一定会导致氨基酸改变，该现象称为遗传密码的简并性，即第3位密码子编码基因时具有摇摆性，可保证遗传密码决定的氨基酸相对稳定，从而保证遗传性状及物种的相对稳定性（Jeacock et al.，2018；Zhou et al.，2018）。

图1 3种大眼蟹线粒体COI基因核苷酸序列（A）及其推导氨基酸序列（B）比对分析结果Fig.1 Alignment of nucleotide sequence（A）and deduced amino acid sequence（B）of mitochondrial COI gene of 3 Macrophthalmus species

2.2 21种大眼蟹COI基因部分序列比较分析结果

21种大眼蟹基因序列对应的物种信息详见表1，用于多序列比对的序列长度为657 bp，连续编码219个氨基酸残基，不存在碱基插入或缺失现象。21种大眼蟹基因的碱基含量略有区别：28.9%～35.9% T、18.9%～27.2% C、25.3%～29.7%A及16.6%～19.0% G（表1）。核苷酸序列比对结果显示，共有390个保守位点及267个变异位点（约占40.6%），与3种大眼蟹基因全序列比对结果一致，绝大多数变异位点出现在第3位密码子（213个变异位点），第2位密码子非常保守，仅有5个变异位点，第1位密码子存在48个变异位点（图2）。同样，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列再进行比对，结果发现变异位点减少至20个，其中还包括10个自裔位点（Singleton site），变异位点率仅占9.13%（图3），同样表现出遗传密码的简并性。

图2 21种大眼蟹线粒体COI基因核苷酸序列比对分析结果Fig.2 Alignment of nucleotide sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

2.3 遗传距离及相似性分析结果

图3 21种大眼蟹线粒体COI基因推导氨基酸序列比对分析结果Fig.3 Deduced amino acid sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

表2 21种大眼蟹科物种线粒体COI基因的遗传距离（左下角）及序列相似性（右上角）Table 2 Genetic distance（bottom left）and sequence similarity（upper right）of COI gene in 21 Macrophthalmidae species

计算21种大眼蟹科物种的基因遗传距离及其序列相似性（表2），结果显示摄氏大眼蟹（）与米氏大眼蟹（）间的遗传距离最小（0.039），二者对应的序列相似性最高（96.2%）；其次为波斯张口蟹（）与大眼蟹科未定种（Macrophthalmidae sp.），二者的遗传距离为0.067，对应的序列相似性为93.6%。日本大眼蟹（）、太平大眼蟹（）和拉氏大眼蟹（）分别与万岁大眼蟹（）、绒毛大眼蟹（）和隆背大眼蟹（）存在最小的遗传距离，分别为0.105、0.179和0.158，对应的序列相似性分别为90.3%、84.3%和86.2%。

2.4 系统发育进化分析结果

基于线粒体基因序列，以三疣梭子蟹和红星梭子蟹为外类群，分别以最大似然法和最大简约法构建大眼蟹科的系统发育进化树，结果发现这2种方法构建的系统发育进化树在拓扑结构和支持率上略有区别（图4）。在最大似然法和最大简约法构建的系统发育进化树中，均表现为日本大眼蟹与万岁大眼蟹的亲缘关系最近、太平大眼蟹与绒毛大眼蟹的亲缘关系最近，但拉氏大眼蟹的进化地位在2种系统发育进化树中存在较大分歧，在最大似然系统发育进化树中与隆背大眼蟹的亲缘关系最近（图4-A），而在最大简约系统发育进化树中与隆背大眼蟹的亲缘关系较远，独立处于一支（图4-B）。值得注意的是，在2种系统发育进化树中均显示大眼蟹属物种并非聚为一支形成单系群。其中，最大似然系统发育进化树分为三大分支，一支由13种大眼蟹属物种组成，另一支由3种大眼蟹属和红树泥方蟹（）组成，剩余一支由平背大眼蟹（）单独组成（图4-A）；最大简约系统发育进化树则分为四大分支，其中两支分别由12种和3种大眼蟹属物种组成，剩余两支分别由拉氏大眼蟹和平背大眼蟹单独组成（图4-B）。此外，2种系统发育进化树均显示薄氏张口蟹（）、波斯张口蟹（）和大眼蟹科未定种聚为一支，具有较高的支持率，故推断该未定种为张口蟹属种类。

3 讨论

自DNA条形码的概念被提出以来，该技术经过20年的迅猛发展，已广泛应用于分类学、生态学、保护生物学和进化生物学等生物领域（胡永春等，2020；毛启迪等，2020），成为不同生物类群物种鉴定、群体遗传及系统进化等研究的重要手段（吉鹏宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗宪广等，2013）。据WoRMS记载，蟹类的物种和形态特征均丰富多样，目前已有7250种短尾类（Brachyuran）被发现。早期的蟹类分类主要依靠经典的形态学方法，但由于形态学分类具有一定的主观性且易受环境因素干扰，因此在蟹类分类及系统发育研究中很可能得到不一致的结论（Ng and Schubart，2003；Naderloo，2011）。如相手蟹科（Sesarmidae）种类形态十分接近，导致该科物种的鉴定和分类长期处于混乱状态（Ng et al.，2019）。Schubart和Ng等（2021）以形态学与分子鉴定相结合的方法，校正了长期混乱的螳臂蟹属（）和假相手蟹属（）的分类问题，重新厘定该科的分类系统（新增8个新属），并对GenBank中相关种类命名提出质疑。

大眼蟹科种类丰富，包括3亚科13属131种，目前鲜见关于该科种类分子遗传多样性及种属亲缘关系的研究报道（徐敬明，2009，2010；Wang et al.，2020）。线粒体、和16S rRNA等基因序列具有序列相对保守、易扩增及进化速度适中等特点，是目前研究物种分类和科内系统进化的重要分子标记（苗宪广等，2013；王淑英等，2014；徐岩等，2019）；但少数串联基因尤其是单基因由于遗传信息位点相对较少，越来越多的研究趋向于依靠线粒体基因组全序列来解决上述难题（Campbell et al.，2014；Lavouéet al.，2014；Zhang et al.，2020）。至今，大眼蟹科仅测定了4个物种（日本大眼蟹、短身大眼蟹、太平大眼蟹和达尔文大眼蟹）的线粒体基因组全序列，故无法有效开展该科系统发育研究。为此，本研究基于线粒体基因序列分析21种大眼蟹的分子多样性水平，同时构建目前最全面的大眼蟹科系统发育进化树。通过比对分析21种大眼蟹基因部分序列，结果发现每个物种均有区别于其他种类的特异位点，因此可考虑作为物种鉴定的分子标记。遗传距离、序列相似性及系统发育进化分析结果均表明，日本大眼蟹与万岁大眼蟹的亲缘关系最近、太平大眼蟹与绒毛大眼蟹的亲缘关系最近。此外，Gen-Bank中的大眼蟹科未定种与波斯张口蟹的亲缘关系最近，然后与薄氏张口蟹聚类形成张口蟹属单系群，从而确定该未定种为张口蟹属种类。

本研究分别以最大似然法和最大简约法构建大眼蟹科的系统发育进化树，结果发现这2种方法构建的系统发育进化树在拓扑结构和支持率上略有区别，究其原因可能是基因包含的有效信息位点有限（仅657 bp），在解析某些物种间的亲缘关系上仍显不足。此外，某些属（如泥方蟹属）仅涉及一个物种，也有可能造成系统发育进化树不稳定。即便如此，2种系统发育进化树均显示大眼蟹属可能是非单系群，后续研究应基于更多基因序列及更多物种数来重点阐述这一现象。