microRNA研究概况及其在农业生产中的应用前景

李祥，刘龙，安世恒，关若冰

（河南省害虫绿色防控国际联合实验室/河南农业大学植物保护学院，河南郑州，450002）

0 引言

成熟的microRNA（miRNA）长度约为18～35 nt，不具有开放阅读框（ORF），因而不能编码蛋白质，其序列在不同物种的基因进化上高度保守，并且在生物发育过程中miRNAs的表达表现出明显的组织特异性和时间特异性（Jonas and Izaurralde，2015；Lukasik and Zielenkiewicz，2016）。miRBase Sequence Database（http：//www.mirbase.org/）作为最大的miRNA信息存储数据库，目前已收录了超过48860个miRNA成熟体序列，涵盖了包括动物、植物和微生物在内的271个物种（Kozomara et al.，2019）。

生物体内绝大多数基因可能受到miRNA的调控，且同一miRNA可能调控多个功能相似甚至功能完全不相关基因的表达（Seitz and Pinzón，2017）。准确识别miRNA的靶基因是明确其功能必不可少的环节。但目前，还没有十分准确、有效的预测手段，已明确了靶基因的miRNA也比较有限，不足以对后续研究提供充足的参考信息，极大限制了mi-RNA的相关研究和生产应用。本研究概述了miRNA的特征、在细胞内的形成过程、对靶基因的调控机制及其在生物体内的功能，尤其是miRNA在昆虫生长、发育以及植物-病原物互作中的关键作用，并讨论了miRNA作为生物农药的研发潜力。在此基础上，进一步从软件预测和试验分析等角度详细论述了miRNA靶基因预测和验证的方法及其优、缺点，并指出当前研究的不足和未来的发展方向，为今后miRNA相关研究和生产应用方面提供一些思路。

1 miRNA在细胞内的形成过程

生物体内的少数miRNAs转录于编码基因的内含子区域，其产生会被所在基因的转录行为所影响；而大多数miRNAs来源于基因间的序列，通常拥有独立的启动子及调控元件（Chang et al.，2015）。当转录因子与miRNA转录序列的调控位点结合后，会激活RNA聚合酶II（RNA polymerase II）并在细胞核内生成初级转录物，即初级miRNA（Primary miRNA，pri-miRNA）（Roden et al.，2017；Creugny et al.，2018）。有研究证实，极少数pri-miRNA（如pri-mir-634）是在RNA聚合酶III的催化作用下形成（Paraboschi et al.，2017）。

miRNA成熟体的形成通常需要pri-miRNA经过2次剪切。在动物细胞核中，pri-miRNAs在Drosha蛋白的作用下，首先被剪切形成miRNA前体（Precursor miRNA，pre-miRNA）（Lee et al.，2003；Roden et al.，2017）。Drosha蛋白隶属于核糖核酸酶III（RNase III）家族，通常存在于细胞核内，能特异性的识别双链RNA结构并将其剪切成3′端具有2个突出碱基的产物（Lee and Shin，2018）。pre-miRNA的长度一般为60～80 nt，可形成典型的茎—环结构以维持较低的自由能（Creugny et al.，2018）。核质转运蛋白Exportin5（Exp5）是一种Ran-GTP依赖性蛋白，能识别并结合pre-miRNA的茎—环末端结构，并将剪切好的pre-miRNA运出细胞核。进入细胞质后，GTP发生去磷酸化反应变为GDP，同时释放pre-miRNA（Kim et al.，2016）。在此过程中，Exp5不仅承担了运输功能，还保护着pre-miRNA不被其他酶类降解（Zeng and Cullen，2006；Wu et al.，2018）。

在细胞质中，RNase III家族的另一个成员Dicer将对pre-miRNA进行第二次剪切，形成一个不稳定的miRNA：miRNA*复合体（Sand，2014）。在此过程中，TRBP（Transactivation-response RNA-binding protein）和PACT（Protein kinase R-activating protein）两类辅助蛋白能大幅提高Dicer对miRNA：miRNA*复合体的亲和力并从中挑选出合适的miRNA成熟体；其中，TRBP负责对底物进行识别和定位（Komori et al.，2020），PACT则促进了Dicer的剪切过程（Wilson et al.，2015）。在miRNA：miRNA*复合体中，稳定性较高的miRNA即成为miRNA成熟体，并将协同AGO、Dicer等蛋白共同形成miRNA沉默诱导复合体（miRNA-induced silencing complex，miRISC），另一个miRNA则会在细胞内被迅速降解（Krol et al.，2010；Carthew et al.，2017）。如果这两个miRNAs的5'末端的稳定性相近，则有可能形成2种不同的miRNA成熟体以及相应的miRISC（Sheu-Gruttadauria and MacRae，2018）（图1）。

植物miRNA的形成方式与动物存在明显的差异，最典型的差异是植物中不存在Drosha或与其同源的蛋白（Chorostecki et al.，2017）。但在拟南芥（）中 发 现 了Dicer的 同 源 物DCL1，并证明了DCL1主要在细胞核内表达，并参与了pre-miRNA和miRNA成熟体的形成过程（Suarez et al.，2015），因而推测DCL1表现出类似Drosha或Dicer的功能。需要注意的是，植物miRNA通常在细胞核内被加工成熟，而动物miRNA的成熟通常发生在细胞质中，进一步佐证了上述推断。此外，植物中HYL1的功能与动物中的TRBP和PACT相似，均发挥协同催化的作用；植物中HST则是Exp5的同源物，被认为是miRNA-miRNA*复合体运出细胞核的载体蛋白（Mengistu and Tenkegna，2021）。

图1 miRNA在动物体内的生物合成过程（Ameres and Zamore，2013）Fig.1 miRNA biogenesis process in animals（Ameres and Zamore，2013）

2 miRNA对靶基因的调控机制

成熟的miRNA会协同AGO、Dicer、TRBP、PACT等元件形成miRISC，并通过对mRNA进行降解或翻译抑制两种不同的作用机制来实现其沉默效应（Tang，2005；Liu et al.，2017）。miRNA与靶基因序列的互补程度则决定了具体的调控机制。

大多数植物miRNA与其靶标mRNA的序列几乎完全互补，其作用机制与siRNA形成的RISC相类似（郝大海和龚明，2020），即与mRNA结合后，miRISC引导其中的外切酶和内切酶同时作用，降解所在的mRNA。反应完成后，miRISC被完整的释放出来并参与下一个剪切事件（Samad et al.，2017）。值得注意的是，植物miRNA与靶基因的结合位点可能存在于整个mRNA序列；而动物miRNA的结合位点通常定位在mRNA的3'UTR。与植物不同的是，动物miRNA仅在靠近5'端的少数序列与靶基因完全互补，而其余序列的互补程度则很低，使得miRNA在动物体内的主要作用方式为翻译抑制。目前普遍认为在动物体内miRISC能在不破坏mRNA结构的前提下，抑制其翻译过程中的某个阶段，导致无法合成或减少合成相应的蛋白产物（Ameres and Zamore，2013；Gebert and Macrae，2019）。动物中多数miRNAs与靶标mRNA的结合位点位于3'UTR，极大降低了靶基因的预测范围。但越来越多的研究报道指出，miRNA-mRNA的结合位点也可能存在于靶基因的编码区（CDS）和5'UTR（Baizhigitova et al.，2018），这使得研究者需要重新评估和审视以前的研究。

3 miRNA对生物的调控功能

3.1 miRNA在生物体内的一般功能

目前对于miRNA的功能研究主要采用反向遗传学的方法。一方面通过突变靶基因的结合位点来观察miRNA的结合情况以及相应的表型变化，另一方面通过过表达或抑制miRNA的表达水平来观察所造成的影响（Gebert et al.，2019）。大多数miRNAs行使调控作用时，往往是微调（Fine-tune）靶基因的表达水平使其维持适宜的表达丰度，因此，改变miRNA的表达量并不一定能观察到十分明显的表型变化。在探索miRNA的功能时，研究者通常采用高通量测序加生物信息学分析的方法，明确miRNA的时空表达特性，并根据miRNA与mRNA的序列互补程度和结合稳定性预测其靶基因，然后结合分子生物学手段对miRNA与mRNA的互作关系进行验证，并根据靶基因的作用判断miRNA的功能。

植物miRNA与靶基因的结合序列几乎完全互补，极大提高了靶基因预测的准确性（崔俊霞等，2018）。已知的植物miRNA靶基因中，很多都是在生长发育中起关键调控作用的转录因子基因（Zhang et al.，2006a；Reichel et al.，2015）。Pandey等（2019）指出，植物miRNA可通过抑制细胞分化过程中的关键基因控制植物细胞发育的方向。动物miRNA的功能鉴定相对困难。由于“不完全匹配”的机制，动物miRNA的靶基因预测会产生大量的假阳性结果，必须经过严格的试验验证才能确定。与植物一样的是，动物miRNA的靶基因中也包含大量转录因子基因，并在生物体生长发育过程中发挥重要功能（Vorozheykin and Titov，2020）。更多的研究表明，miRNA表现出能调控大多数生理和病理过程的潜力，包括发育阶段的划分、干细胞分化、神经发育、细胞生长和凋亡、激素分泌、脂类代谢、病变和癌症等（Llave and Carrington，2002；Vikram et al.，2015）。此外，不同外部因子或内部生理变化所导致的表达差异暗示了miRNA具有更广泛的作用。近年来，生物信息学分析结果表明，miRNA具有多元化的调控路径，甚至具备调控所有生理活动的潜力（Gebert and Macrae，2019）。

3.2 miRNA在昆虫发育中的功能

作为生物体内一类重要的调控因子，miRNA广泛参与了昆虫的生长发育、生殖、代谢、免疫防御等绝大多数的生理生化过程。在果蝇中，通过敲除AGO蛋白阻止miRNAs发挥功能，能显著抑制其卵母细胞的形成（Azzam et al.，2012），且构建基因缺失的突变品系能阻碍果蝇卵母细胞的成熟（Nakahara et al.，2005）。在褐飞虱（）中抑制基因的表达，获得了与果蝇相似的表型（Zhang et al.，2013）。、等通过调节Notch信号通路和骨形态发生蛋白信号通路中关键基因的表达，可阻止果蝇的生殖干细胞（Germline stem cells）分 化（Poulton et al.，2011；Li et al.，2012），而启动生殖干细胞的分化也同样需要miRNA的调控（如）（Pek et al.，2009）。昆虫神经系统发育同样需要miRNA的参与，如（Li and Carthew，2005）、（Loya et al.，2009）、（Weng and Cohen，2012）等；缺失这些miRNAs的表达则会导致神经退行性功能缺失、神经干细胞分化异常、信号传导受阻等发育或功能缺陷。是参与昆虫边界形成的关键基因之一，能通过抑制基因的表达从而阻止果蝇翅芽盘（Wing imaginal discs）的细胞增殖；基因被抑制后，其靶基因大量表达，该基因又进一步促进了翅芽盘上背—腹轴向的分化（Becam et al.，2011）。基因的时序性表达从时间维度上控制了翅芽盘上的细胞增殖，缺失的果蝇翅尺寸会明显减小（Caygill and Johnston，2008）。

miRNA对昆虫变态发育中的激素代谢、蜕皮行为、组织降解和重建同样具有重要的调控作用（Ylla et al.，2016；Belles，2017）。在果蝇的整个发育过程中，多个miRNAs的表达水平与蜕皮和变态过程密切相关。蜕皮激素功能通路中的关键基因能显著上调、、等基因的表达水平，并抑制基因的表达，共同维护蜕皮过程的有序进行（Sempere et al.，2002，2003）。能靶向果蝇中蜕皮激素的受体基因，从而形成一个反馈调控环，以维持蜕皮激素的适宜滴度并适时启动或终止相应的蜕皮过程（Varghese and Cohen，2007）。在家蚕（）中，同样能作用于蜕皮激素调控网络的多个基因和步骤，共同维持生长发育的有序性（He et al.，2019a，2019b）。通过负调控转录因子dLMO来控制果蝇翅发育过程的细胞凋亡，塑造适宜的翅形（Epstein et al.，2017）；在褐飞虱的长、短翅型分化和发育中，基因能响应寄主营养水平和胰岛素受体基因的信号调控，通过调节基因的适宜表达水平来促进种群向长翅化或短翅化发展（Li et al.，2021）。这也间接说明miRNA对昆虫生理生化过程的调控作用存在一定的保守性，在今后的应用实践中，应经过合理的筛选和验证，基于miRNA调控作用的药剂开发可兼顾特异性和广谱性双重优势。

3.3 miRNA在植物抗病中的功能

miRNA不仅通过作用于转录因子来调控植物自身的生长发育，还参与植物与病原物的“斗争”。这些致病微生物通过表达或诱导寄主植物表达某些miRNAs来抑制寄主的免疫防御，协同致病过程（Umbach and Cullen，2009）。例如丁香假单胞菌（）侵染拟南芥时，通过诱导寄主过表达来抑制自身防御基因和的转录，关闭植物的免疫过程（Niu et al.，2016）。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）通过编码一种2b蛋白与寄主植物的AGO1蛋白竞争性结合，从而阻碍植物对自身miRNA的加工和修饰，导致由miRNA介导的寄主防御反应受到抑制（Zhang et al.，2006b）。另一方面，植物在抵御致病微生物的侵染时，会有目的地上调或下调一些内源性miRNAs的表达，用于激活自身免疫系统，以提高对病原物的抗性。当烟草受到烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus）侵染时，通过降低自身的表达水平来促进免疫基因的表达，以抵御该病毒（Jiang et al.，2019）。

利用基因编辑或转基因技术，可有目的地使植物过表达某些特定的miRNAs，从而沉默病原物的关键致病基因。该项技术已应用于水稻、番茄、烟草等作物的品种选育（Schwab et al.，2006；Ossowski et al.，2008）。例如，在烟草基因组中插入人工构建的miRNA前体序列，使其特异性地过表达目的miRNA片段，可以沉默马铃薯Y病毒（Potato virus Y）的致病基因HC-Pro和马铃薯X病毒（Potato virus X）中的致病基因p25，最终削弱这两种病毒对烟草的致病能力（Ai et al.，2011）。针对田间多种病害混合发生的现状，可以针对病原物致病基因的保守序列构建miRNA表达载体，以拓宽农作物的抗病谱（Zheng and Qu，2015）。

4 miRNA的靶基因预测

随着高通量测序技术和生物信息学的发展，生物中大量miRNA被相继鉴定出来。一些miRNAs通过作用于昆虫、植物或病原微生物中的关键基因，从而调控昆虫的生长发育和植物-病原物的互作过程，在农业害虫防治和植物抗病免疫等方面显示出非常好的应用潜力。基于RNA沉默技术的生物农药研发也因此成为可持续植保发展的热点研究领域。但如何从包含成百上千个miRNAs的生物转录组中准确筛选和鉴定出对靶标基因具有调控作用的mi-RNA成为限制该领域发展的一个难题。早在21世纪初期，Lai（2002）比对了果蝇中调控基因和基因的11个miRNAs，结果发现二者的miRNAs 5'端的前8个碱基（实际为靠近5'端的6个碱基）与靶基因序列能精确互补，称这些碱基为种子序列（Seed region），并推测种子序列是miRNA发挥转录后调控作用的关键因素。这一发现确立了以种子序列为依据进行miRNA靶基因预测的计算机理论基础。迄今为止，尚未发现比利用种子序列进行预测更准确的手段。近十几年来，逐步确立了以种子序列为核心，miRNA-mRNA复合体的热稳定性和二级结构为依据的理论体系，并诞生多种各具特色的预测软件（Chen et al.，2018）。

4.1 根据miRNA-mRNA复合体的热力学稳定性进行预测

miRanda是首个以miRNA与潜在靶基因之间热力学稳定性为依据进行预测的软件，该软件不受物种限制，还可在Windows、Linux等多种操作平台上进行不联网运行（Ahmadi et al.，2013）。miRanda强调miRNA与靶基因互补序列在进化上的保守性，主要参考miRNA 5'端序列与靶序列之间C：G、A：U、G：U的配对情况进行热稳定性评估，并构建出相应的打分矩阵，同时根据miRNA 5'端和3'端各自的互补特性进行区别评分。用户还可根据实际需要自行定义阈值，从而筛除不稳定的复合体（Ahmadi et al.，2013；程爽等.，2018）。此后，更多基于热力学稳定性的miRNA靶基因预测软件被相继开发。例如，RNAhybrid算法强调根据结合能来推算最佳结合位点，并获得最稳定的配对模式，避免了miRNA和靶基因之间形成无关的复合体结构（Krüger and Rehmsmeier，2006；Pio et al.，2014）。PITA算法仅根据靶基因的3′UTR对已形成稳定二级结构的序列进行剔除（Beretta et al.，2017；Kertesz et al.，2017），但出现跨度较大的互补配对情况或较大的二级结构时，该算法会产生一部分假阳性结果。

基于miRNA与靶基因的作用方式，以及不同miRNAs间的序列比对分析，Miranda等（2006）开发了第二代预测软件——RNA22。该软件是首个不使用同源保守信息进行预测的软件，具有很强的灵活性，可将靶点的预测范围延伸至整个mRNA序列。RNA22以Rfam 3.0数据库中miRNA成熟体为训练集合，采用一种模糊匹配的模式进行预测。该算法将供试序列分割成靶点岛（Target island），并依次评估与miRNA的结合情况来寻找假定结合位点（Miranda et al.，2006；Plotnikova and Skoblov，2018）。

4.2 根据物种间的序列保守性进行预测

种子序列通常在物种之间的保守性很高，研究者可根据靶基因序列的同源性进行预测。TargetScan是目前使用频率最高的预测软件。该算法提出了“假阳性率”的概念，并根据物种之间的保守性原则对预测结果进行二次评估（Agarwal et al.，2015）。TargetScan首先搜索并比对不同物种之间的mRNA 3'UTR序列的保守区域，然后根据miRNA与潜在靶标的3'UTR及其周围序列的互补程度进行综合评估（Lewis et al.，2005；Wu et al.，2017）。该算法以保守性为主要依据，其局限性在于不能对具有物种特异性的互补情况进行有效预测。TargetScan S则是在TargetScan基础上进行了优化，不再对miRNA非种子序列区域与靶序列匹配的自由能进行评估，而是增加对人类、鼠、狗、鸡等一些进化距离较远的物种进行保守性分析，进一步提高了预测的准确性（Huang et al.，2019）。

4.3 基于多个结合位点进行预测

miRNA不仅可调控多个mRNAs，也可作用于同一mRNA的多个位点。基于此现象，对多个结合位点进行同时预测时，可通过增加信噪比参数对预测结果进行适当地筛除。尽管这种算法可能会过滤一些真实靶标，但其优势在于预测结果更加准确（Ritchie et al.，2009a，2009b）。PicTar主要应用于脊椎动物和无脊椎动物中的miRNA靶基因预测，是多靶标和多结合位点预测的代表算法。该算法不仅能同时评估多个结合位点，还对miRNA-mRNA结合能力进行综合评估，甚至允许种子序列出现不完全匹配的情况，并进行区别打分（Sarker et al.，2011）。此外，该算法还考虑了结合位点的保守性因素，并关联了多个网站的miRNA信息数据库。

4.4 根据miRNA和mRNA的表达水平进行预测

一些miRNA通过降解mRNA来阻断其翻译过程（Ameres and Zamore，2013；Samad et al.，2017），因此，在miRNA表达活跃的区域，相应的靶基因表达水平通常较低。检测特定组织中miRNA与mRNA表达量的关系，也是靶基因筛选的一个重要手段（Jing et al.，2016；Ye et al.，2019）。该方法不同于匹配原则的算法，可以对基于序列互补原则而获得的结果进行二次筛选，另一个优势在于不单纯依赖于3′UTR进行预测。但在动物中，一些miRNAs并不能直接影响mRNA的表达水平，或者影响十分微弱，导致很多真实的结果被忽视，此时可用检测相关蛋白的表达水平代替对mRNA的检测。

4.5 根据功能相关性进行预测

miRNA参与了生物体内大多数的生理生化过程（Llave and Carrington，2002；Lim et al.，2005），因此，可根据其功能分类对无关的预测结果进行剔除。mirBridge算法锚定一组或一类已知功能的mRNA，有针对性的对这些潜在靶标进行排查（Tsang et al.，2010）。此算法适用于一些具有特殊功能的基因或通路研究，但对于尚未进行功能划分的miRNA和mRNA无法预测。

4.6 根据miRNA信息库寻找潜在靶标

随着miRNA-mRNA互作研究成果的不断积累，一些研究者或机构建立了多种miRNA数据库，以整合miRNA及其靶基因的相关信息。starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）网站较为全面的收录了由miRNA介导的mRNA降解组和CLIP-Seq等高通量测序数据，包含了miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA、miRNA-ceRNA等多种互作模式下的miRNA靶标信息。ChIPBase（http：//deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/）偏向于探讨miRNA的转录和转录后调控作用，构建了比较系统的“转录因子-miRNA-靶基因”调控网络。Tarbase（http：//microrna.gr/tarbase/）侧重于收集已被试验证实过的miRNA靶基因信息。此外，PMRD主要收录植物miRNA的数据信息，miRGator v2.0则重点整合了疾病相关miRNA的研究结果。鉴于miRNA在序列和功能方面的保守性，收录的研究结果被广泛借鉴于当前的研究。但受限于miRNA相关研究的不系统性，这些网站建立的数据库仍不够全面。

5 miRNA的靶基因验证

尽管目前已存在大量各具特色的预测软件，但这些算法主要依赖于miRNA与靶基因的互补潜力进行预测，并强调种子序列的重要性。由于miRNAmRNA复合体允许一定程度的错配、跳跃、G：U配对的情况出现，在很大程度上会出现许多错误的预测结果。在实际研究中，需要对预测的结果进行进一步分析和验证。

miRNA的靶基因验证试验最初是以线虫体为研究对象，通过构建miRNA缺失的突变体以获得相反表现，从而证明miRNA与mRNA的调控关系（Lee et al.，1993）。这种方法受基因编辑技术等因素的局限，无法在生物中推广使用。Vatolin等（2006）、Andachi（2008）将一段已知序列的特异性接头连接至miRNA后进行反转录和扩增，进一步通过定量分析或高通量测序的方法成功鉴定出、LIN-14等靶基因。

当前验证miRNA与靶基因的互作关系时，通常是人为构建出一套表达系统用于模拟相应的调控过程，并检测mRNA表达的蛋白产物含量。报告基因检测系统是验证miRNA与靶基因互作时最常见的研究手段。当miRNA与mRNA上的作用位点结合后，能有效抑制其翻译过程，并显著减少蛋白产物的含量（Huang et al.，2020；Li et al.，2021）。将包含潜在结合位点的一部分或全部序列连接至报告基因（通常为荧光素酶基因）CDS的下游，并将构建好的重组质粒导入细胞系内进行表达；同时将miRNA的模拟物或表达载体共同转染至细胞系中，经过一段时间后检测荧光强度或者荧光素酶的活性。为核实miRNA与靶基因的作用位点，还可将结合位点序列进行突变，从而反向观察结合情况，检测报告基因的表达水平，用以验证预测位点的真伪（Ritchie et al.，2010；Ye et al.，2019）。当细胞系内源表达的miRNAs包含供试miRNA时，也可通过外源转入miRNA的抑制剂（如Inhibitors或Sponge vectors）对其表达进行抑制（Tang et al.，2017；Zhang et al.，2018）。经过miRNA处理后的细胞系，报告基因表达的蛋白产物可通过Western杂交、免疫组化、流式细胞术等方法进行定量分析（任禹珂等，2021）。需要指出的是，报告基因检测系统中miRNA和结合序列是在人工干预的异源系统里进行相互作用，而在活体中miRNA和靶基因的表达均存在时空特异性；克隆到载体上的序列可能会因为二级结构发生变化而产生假阳性或假阴性的结果；细胞系内复杂多样的生理生化过程也可能会干扰试验结果。

6 展望

病虫害的频繁发生一直是限制农业发展的重要难题。化学农药是当前防治病虫害的主要手段，但其不合理的使用造成了严重的环境问题和人畜安全问题。选育抗病虫品种往往费时费力，难以满足生产的迫切需求。基于RNA沉默技术的RNA生物农药的研发带来了新的农药革命，该方法可用于杀虫剂、杀菌剂、除草剂等多种新型农药的研制，并兼具特异性强、环境友好等特点，为可持续植保的发展提供了新的途径（Dhandapani et al.，2019；Niehl and Heinlein，2019）。

鉴于miRNA在动物和植物中的重要功能，开发miRNA生物农药成为未来病虫害防治的重要选择。如何使目的miRNA成功作用于靶标生物，是利用该技术进行病虫害防治的关键。目前主要总结了两种miRNA递送方式：一种是利用转基因或基因编辑技术使植物内源表达目的miRNA片段，待病原物侵染或昆虫取食时，miRNA进入有害生物体内发挥相应的功能，该方式被称为寄主诱导的基因沉默（Hostinduced gene silencing）；另一种方式是将体外合成的功能性miRNA经过稳定性处理制作成相应的杀菌剂或杀虫剂，直接施用在作物上，该方式被称为喷洒诱导的基因沉默（Spray-induced gene silencing）（Wang and Jin，2017；Zotti et al.，2018）。迄今为止，至少有5项基于RNAi原理的生物农药获准在田间投入使用，展现出了良好的应用前景。但需要指出的是，并不是所有的植物都能通过转基因技术培育商业化的抗病虫品种，也不可能做到同时防治多种病虫害。对于外源施用的RNA生物农药，除了较高的生产成本外，在田间的稳定性和持效性也一直是研究人员需要解决的难题。此外，为了避免脱靶效应和潜在的安全风险，miRNA的序列设计和靶基因的筛选均必须经过严密的科学论证。

经过十余年的发展，miRNA靶基因的预测和鉴定已发展成为一门较为系统的学科，为miRNA的功能鉴定和应用研发提供了便利。本研究对当前mi-RNA靶基因预测和验证的研究方法进行较为系统地概述和比较，不仅指出这些方法的优势和特色，还认识到当前研究手段的不足。通常，miRNA-mRNA复合体的形成需要考虑时间和空间上的特异性，因此，基于序列匹配的算法预测实际上并不能真实反应生物体内的相互作用模式。现有的预测方法是在不丢失真实靶标的原则下尽量剔除无关结果，但受限于目前的miRNA理论研究的不足，想要兼顾预测的灵敏度和精确度仍有较大的距离。鉴于各种算法各有其利弊，学者们通常利用多个算法或手段分别进行预测后，再对结果集合进行比对。

对于今后miRNA靶基因预测领域的发展，可着重关注以下3个方面：（1）miRNA和mRNA的互补配对要考虑表达时间和空间上的一致性；（2）尽管已有不少算法增加了RNA二级结构分析，但对于较长序列的结构预测仍缺乏准确性，预测时也没有考虑规避蛋白结合位点等功能区域；（3）miRNA-mRNA复合体的形成及稳定性机制方面的研究仍不够完善，现有的理论基础不能很好的支撑新算法的研发。在验证预测结果时，还应注意以下情况：（1）miRNA过表达时通常能使其表达水平上调成百上千倍，可能会引起一些副作用并干扰了其他内源基因的表达；（2）人工干预下的靶基因验证系统往往忽略了miRNA和mRNA的组织特异性表达特性；（3）改变miRNA的表达水平可能导致上千个基因的转录水平发生变化，但这种变化可能来自于靶基因变化而引起的间接调控；（4）不同miRNA在与靶基因结合过程中可能存在竞争或者协同作用，单一改变某个miRNA的含量可能无法模拟出真实的情况；（5）miRNA对靶基因的上调作用在目前的研究中往往被忽视。