碳量子点酒对幽门螺旋杆菌药效学研究及作用机制预测

张喜武，胡志欣，王雅泓，窦金金

（1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨成程生命与物质研究所，黑龙江哈尔滨 150500；3.黑龙江中医药大学第一附属医院，黑龙江哈尔滨 150040）

幽门螺旋杆菌（，Hp）是一类对生存环境较为苛刻的革兰阴性细菌，菌株整体以螺旋状存在，其作为一种流行的致病细菌，常在胃部汇集并复制感染。作为I 类致癌物，全球感染Hp的人口已占半数之多，有些国家甚至有90%的人口曾感染过此类细菌。Hp 在胃内定植主要依靠此类细菌独特的酸适应机制，治疗不及时常会诱发消化性溃疡、胃腺癌等疾病，甚至与心血管、神经、肝胆等系统疾病也息息相关。现如今临床上最常使用的治疗方法即抗生素三联疗法，然而随着耐药菌株的出现其治疗效果不尽人意，常常无法根治甚至出现反复感染的现象，且由于使用抗生素产生的不良反应导致患者耐受性下降，对机体损害较大。因此，寻找治疗及预防幽门螺杆菌感染的新方法具有必要性。

酒是中医药科学重要组成部分，其发展史源远流长，《本草求真》记载：“酒能升阳发散，若引经用为向导，则其势最速，辛则通身达表，引入至高颠顶”，祖国医学常用酒配药治疗各种疾病。女性更年期综合征如今呈现发病早、发病率高的趋势，常伴焦虑、抑郁和睡眠障碍等症状，本研究者基于此研发了一款女士酒，主要成分为丁香、木瓜等8 味中药，现已授权发明专利（ZL201910659190.0），其中丁香具有消炎抑菌及抗肿瘤护肝的作用，木瓜具有抗胃溃疡、修护肠损伤、以及保肝抗炎加强机体免疫的功效。酒中有效成分为所添加8 味药食同源中药的醇溶性成分，因此同时具有药食两用性，近年来常以食补、药膳等形式应用于医疗保健。碳量子点采用超音速对撞粉碎及光电碳化技术制备碳量子点溶胶，为一种新兴纳米给药技术，并采用科学吸附技术，将原酒中的氰化物、重金属等有害物质清除，将影响口感的杂醇、杂质有效吸附，再通过高频脉冲设备将酒中对人体有益物质高度活化，女士酒和碱性白酒均采用此技术制备而成，不仅具有更好的吸收效果，还兼备了低毒性、生物相容性等优点。酒精是性质良好的有机溶剂，可使中药中的有效成分更大程度溶出，近年来多有研究表明，适量、规律饮酒不仅对机体无损伤，而且对一些疾病甚至具有预防及治疗作用。此外，在对服用女士酒、碱性酒的跟踪调查中意外发现，感染幽门螺旋杆菌的人群中出现了不同程度的好转甚至痊愈。基于此，本实验针对女士酒、碱性酒对Hp 的抑制作用进行研究，探讨其对Hp 感染小鼠胃部病态变化的影响，并结合网络药理学，通过各数据平台检索筛选，对白酒中有效成分抑制Hp 作用靶点及相关通路进行分析预测，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级KM 小鼠 70 只，18～22 g，雌雄各半，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证号（SCXK（黑）2018-003）；碳量子点女士酒（主要配方：每1 L 原酒中含丁香、木瓜、桑葚、天门冬及大枣各5 g，含熟地黄、刺五加、枸杞各2.5 g，加入冰糖将酒精度调至35°，含糖量50 g/L）、碳量子点碱性白酒（pH＞7，酒精度58°） 黑龙江沃生生命波团簇酒业有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基、圆底立式厌氧培养袋、2.5 L 微需氧产气包 青岛海博生物；幽门螺旋杆菌试纸 广州贝思奇诊断试剂有限公司；幽门螺杆菌国际标准菌株（ATCC 43504） 上海北诺生物科技有限公司。

37 ℃恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；超净工作台 苏州净化设备有限公司；高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 本实验中包含的动物试验均符合相关国家标准，实验过程中严格遵守本校实验动物伦理委员会所制定的动物伦理学规范，相关操作均得到委员会批准。将实验小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性药物组（抗生素三联：甲硝唑14.2 mg/kg+克拉霉素7.15 mg/kg+奥美拉唑400 nmol/kg）、女士酒高剂量组（49.4 mL/kg）、低剂量组（24.7 mL/kg）及碱性酒高剂量（49.4 mL/kg）、碱性酒低剂量组（24.7 mL/kg），10 只小鼠为一组，共7 组。各给药组给药剂量参照人类临床常用剂量并结合相关文献设计定量，并依据人与动物体表面积计算法换算得到各组小鼠灌胃剂量。每天定量给予实验小鼠专用鼠粮，自由饮水，保持环境温度湿度恒定，饲养7 d 以适应周围环境，之后开始造模。按

1.2.2 项下步骤进行模型复制，造模结束后，将各组对应药物配制成相应浓度，均以每日0.2 mL/10 g 灌胃，空白组及模型组给予等量生理盐水，连续给药20 d。药物干预期间各组小鼠保持饲养条件一致，正常摄食饮水。

1.2.2 模型复制及评价

1.2.2.1 ATCC 43504 细菌培养 在超净工作台上吸取100 μL 复苏后的Hp 菌悬液，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，待培菌液吸干倒置放入含有微需氧产气包的厌氧培养袋中，密封后置于37 ℃恒温培养箱中。待细菌长满平板，如图1a，用接种环轻轻挑取菌落，涂于Hp 试纸上，试纸颜色由黄变紫。用生理盐水洗下菌落，于600 nm 条件下测量菌液OD 值，并调节浓度至1×10CFU/mL，收集于试管中，上下翻倒轻轻摇匀后立即灌胃。

1.2.2.2 模型复制 采用上述留存的ATCC 43504菌悬液，浓度为1×10CFU/mL。造模前禁食24 h，除空白对照组，其余组小鼠均先用5%碳酸氢钠灌胃0.2 mL/只，30 min 再灌胃Hp 菌液0.2 mL/只，而后继续禁食禁水3 h，之后恢复正常饲养。隔天感染一次，共8 次。空白对照组给以等量生理盐水。

1.2.2.3 模型评价 末次灌胃菌液2 h 后采用脱颈法处死小鼠，所有操作均按照动物伦理学规定进行，快速完整取胃，观察胃部形态变化。沿胃大弯剖开胃，清理干净后小心刮取胃黏膜组织进行尿素酶试纸检测。造模成功后按上述给药方式分组给药。

1.2.3 药效检测指标及方法

1.2.3.1 一般体征观察 各组小鼠在实验期间均定量给食，自由饮水，密切观察实验动物一般情况，如灵活程度、精神状况、毛发状态、情绪变化及进食进水情况，定期称量体重。

1.2.3.2 胃部大体形态学观察 末次给药后将小鼠脱颈处死，沿腹部剖开，剥离其他组织，完整取出小鼠全胃。用生理盐水清洗胃标本，然后用吸水纸轻轻吸干，观察胃部大体形态学变化。

1.2.3.3 胃窦部粘膜组织尿素酶检测 将小鼠胃组织沿胃大弯剪开，除去胃中残留食物等杂质，用生理盐水清洗干净后轻轻刮取胃窦部粘膜组织，用Hp 试纸进行尿素酶检测，按以下标准记录结果：强阳性：试纸 1 min 内变红；弱阳性：试纸3 min 内变红；阴性：试纸不变色。

1.2.3.4 胃组织病理学HE 染色 将小鼠胃部剖开平展，放入装满生理盐水的烧杯中，反复涮洗至附着的血渍及杂质全部去除，然后浸泡于4%多聚甲醛溶液中，使用不同浓度的乙醇冲洗以去除组织中的水分，之后使用石蜡将组织包裹，按需切成一定厚度的薄片，染色后倍镜下观察，分析小鼠胃黏膜处是否出现炎症及胃部微观病理变化。

1.2.3.5 肝组织病理学HE 染色 取胃后继续分离出肝脏，按1.2.3.4 所示步骤染色处理，观察肝组织变化。

1.2.4 碳量子酒对Hp 抑制作用的网络药理学研究

1.2.4.1 白酒微量化学成分收集及靶点预测 查阅白酒相关文献，对其中主要健康成分进行初步筛选。然后在化源网及Pub Chem 网站对其进行检索，采集2D 结构的sdf.文件，并通过SwissADME 对化学成分进行性质筛选，选取并记录“GI absorption”值为High 且“Druglikeness”项下不少于三个Yes 的成分。借助TCMSP 数据平台检索化学成分的潜在作用靶点，通过UniProt 数据库得到物种分类为“Human”且已证实的与作用靶点对应的基因名。

1.2.4.2 疾病相关靶点预测收集 以“H.pylori”为关键词，物种设置为“Homo sapiens”，在GeneCards 数据库进行疾病靶点的搜索预测。

1.2.4.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将收集的酒中健康成分相关靶点与筛选到的疾病相关靶点导入Draw Venny Diagram 获取交集。通过cytoscape 3.7.1 对交集靶点分析并构建蛋白互作网络图，利用“Network analysis”插件对数据进行处理，获取核心靶点。

1.2.4.4 GO 生物功能注释和KEGG 通路富集 借助生信自学网对＜0.05 的交集靶点进行GO 及KEGG通路富集分析，其中GO 分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三个部分。

1.2.4.5 靶点-信号通路网络构建 将1.2.4.4 项下通过KEGG 富集分析得到的排名前20 的通路进一步筛选，去除其中有关癌症、病毒的信息，得到与疾病关联紧密的通路。而后将各通路及通路上富集的靶点制成network 文件上传至cytoscpe 3.7.1，绘制出靶点-信号通路网络图。

1.3 数据处理

统计学分析采用SPSS 26.0 软件进行。数据以平均值±标准差（x ¯±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，其中＜0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 模型评价结果

结果如图1 所示，模型小鼠尿素酶试纸于1 min内由黄变紫，结果呈阳性，如图1b；空白组小鼠试纸检测未变色呈阴性，如图1c。空白小鼠胃部红润光泽，整体完整无变形，如图1d；而模型组小鼠见图1e，外部暗红发紫，表面出现很多黑色凸起，整体皱缩，病变明显。将胃沿胃大弯展开后，模型组与空白组胃部对比如图1f，可见模型组组织上出现点星状出血。综上所述，可判断模型复制成功。

图1 模型评价结果Fig.1 Results of model evaluation

2.2 药效学评价结果

2.2.1 一般体征观察及体重变化曲线 实验期间，空白组小鼠精神情况良好，日常活泼好动，饮食积极；模型组小鼠整体状态逐渐转差，较呆滞，抓取时易受惊吓，掉毛严重，小鼠体质量在后期增加缓慢，与其他组差异逐渐明显；给药组与模型组相比，整体状态逐渐恢复，鼠毛由粗糙干燥逐渐恢复干净顺滑，摄入排泄均正常。

体重变化见表1，实验前期由于灌胃反复抓取导致所有组别小鼠体重均有所下降，适应后恢复正常。相比于空白组，模型组小鼠体重增长缓慢，实验后期两组间差距明显；与模型组相比，给药组小鼠体重在实验后期恢复正常，稳定增长。其中女士酒高、低剂量组相比于碱性酒组体重增长幅度小，这可能与女士酒中添加的中药成分具有改善肠道菌群，促进消化的功效有关。

表1 小鼠体重变化Table 1 Body weight changes of mice

2.2.2 胃部大体形态学观察 结果如图2 所示，空白组小鼠胃部颜色红润，外部平整；模型组小鼠胃部呈现暗紫色，表面凹凸皱缩，出现明显病变，并可见表面存在点星状充血；抗生素三联治疗组小鼠胃部颜色淡红，外部平展，与空白组较为接近；供试药组上述情况均出现明显好转，且女士酒、碱性酒高剂量组相比低剂量组效果更佳。

图2 酒对幽门螺杆菌感染小鼠胃部大体形态影响Fig.2 Influence of alcohol on the general morphology of stomach in mice infected by Hp

2.2.3 女士酒、碱性酒对Hp 感染小鼠胃窦部粘膜组织尿素酶的影响 由表2 可知，与空白组相比，模型组尿素酶检测强阳性率及总阳性率均显著升高（＜0.05），可判断小鼠感染模型复制成功；给予抗生素三联、女士酒及碱性酒灌胃治疗后，阳性对照组、女士酒高、低剂量组及碱性酒高剂量组强阳性率、总阳性率均极显著降低（＜0.01），说明女士酒及碱性酒对Hp 在胃窦部的定植、生长存在抑制作用，且女士酒抑制作用较强，女士酒高剂量组作用效果与抗生素三联组较相近；各给药组抑菌能力呈现剂量依赖性。

表2 酒对Hp 感染小鼠胃窦部粘膜组织尿素酶的影响Table 2 Effect of alcohol on the urease of gastric antrum mucosa in mice infected by Hp

2.2.4 胃组织标本HE 染色 如图3 所示，空白组小鼠胃黏膜处细胞分布均匀，规则排列，未见炎症、损坏等病变；模型组胃标本切片明显可见胃腺细胞缺失，排列凌乱，出现大量炎性细胞浸润现象；给药后上述情况出现好转，女士酒、碱性酒低剂量组炎性细胞明显减少，炎症程度明显降低；女士酒、碱性酒高剂量组几乎不可见炎症反应，胃腺细胞分布较清晰工整；与阳性对照组及空白组切片情况较为接近。

图3 酒对Hp 感染小鼠胃组织标本影响（HE 染色，200×）Fig.3 Influence of alcohol on gastric tissue specimens of mice infected by Hp (HE staining,200×)

2.2.5 肝组织标本HE 染色 如图4 所示，各组之间切片差异较小，并未产生病理性病变，细胞整体均匀紧凑，细胞核完整，无肿胀坏死，模型组泛红充血处有少量炎性细胞，其余各组未见炎症发生，说明此饮用量对肝脏无损伤。图4b、图4d 左上角泛红充血为取材导致的血管淤血，图4e 颜色较浅为切片较薄所致。

图4 肝组织标本（HE 染色400×）Fig.4 Liver tissue specimen (HE staining 400×)

2.3 碳量子酒对Hp 抑制作用的网络药理学研究

2.3.1 白酒微量化学成分靶点预测 如表3，通过文献查阅及筛选共得到21 个满足要求的所需化学成分。将化学成分及对应靶点蛋白名导入cytoscape 3.7.1 中绘制化学成分-靶点作用网络图，图中共有个330 节点、546 条边，详见图5。

图5 白酒化学成分-靶点作用网络图Fig.5 Liquor chemical composition-target interaction network diagram

表3 白酒中化学成分对应靶点Table 3 Corresponding targets of chemical components in liquor

2.3.2 Hp 关联靶点预测 在1.2.4.2 所述数据库中共得到1789 个疾病靶点，根据“Relevance score”值计算中位数，去除小于中位数的靶点，最后得到疾病相关靶点905 个。

2.3.3 PPI 网络的构建 通过Draw Venny Diagram得到74 个成分-疾病交集靶点，如图6 所示，其中蓝色代表成分靶点，粉色代表疾病靶点，中间交集即共有靶点。利用cytoscape 3.7.1 对交集靶点分析并构建蛋白互作网络图，通过“Network analysis”插件对数据进行处理，得到蛋白靶点各参数，分别计算“Degree”、“Betweenness”、“Closeness”、“LAC”和“NeighborhoodConnectivity”值的中位数，舍弃小于中位数的靶点，最后得到HNRNPU、HNRNPA1、U2AF2、CUL4B、ACTB、PARP1、NEDD8 等53 个核心靶点，该网络包括151 个节点，1060 条边，如图7所示。

图6 交集靶点韦恩图Fig.6 Wayne diagram of common target

图7 PPI 网络图Fig.7 PPI network diagram

2.3.4 GO 及KEGG 富集分析 选取KEGG 分析排名前20 且＜0.05 的通路途经，绘制气泡图，如图8。此外，对生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）进行GO 分析，选取排名前15 且＜0.05 的功能信息作图。

图8 KEGG 和GO 富集分析气泡图Fig.8 Enrichment analysis of key KEGG and GO pathways

2.3.5 靶点-信号通路网络构建 筛选结束最终得到8 条与Hp 疾病相关联的通路，分别为IL-17 信号通路、脂质和动脉粥样硬化、细胞凋亡、TNF 信号通、致病性大肠杆菌感染、MAPK 信号通路、T 细胞受体信号通路以及PI3K-Akt 信号通路。然后采集通路上富集的靶点，根据所需制成network 文件，通过cytoscape 3.7.1 绘制出靶点-信号通路网络图（图9）。

图9 靶点-信号通路网络图Fig.9 Target-signal pathway network diagram

3 讨论与结论

根据国家保健食品相关标准规定，女士酒、碱性酒作为补养型保健酒类产品，通过调节人体机能，进而发挥增强人体免疫力，调节肠道菌群及对胃黏膜损伤有辅助保护功能，日常均可合理饮用，酒中含有的微量成分，不仅对白酒的口感及质量有不同程度的影响，还可促进机体循环、缓解疲乏，舒缓身心。由药效实验结果可知，合理饮酒可阻碍Hp 在体内的定植及增殖，发挥抑菌作用，其中女士酒作用更强，这主要是因为女士酒中含有木瓜、丁香等8 味中药，酒-药相互协作，增强了抑菌效果。中医认为，幽门螺杆菌感染属于阳明胃热类疾病，而丁香、木瓜具有温中降逆、和胃化湿之功效且均有较好的抗炎杀菌功能。已有研究表明，丁香挥发油中的主要成分丁香酚可与Hp 通过特定方式结合，从而影响其活性，达到理想抑菌作用；并且在体外抑制幽门螺杆菌实验中丁香醇提物也显现出了更强的抑制作用。覃慧林等发现木瓜乙酸乙酯萃取部位对急性胃溃疡引起的胃粘膜损伤具有保护作用，此外，亦有实验证实木瓜总三萜可抑制机体炎症小体信号通路，进而对Hp 引起的胃炎发挥抑制作用。本研究通过建立Hp 小鼠感染模型，证实了女士酒、碱性酒能够影响Hp 在小鼠体内的定植及活性，提高了对胃黏膜处Hp 的清除率且呈现剂量依赖性，同时能够减轻胃窦部由于细菌感染引起的炎症。根据肝脏病理切片可知此给药量对肝脏不会造成损伤，且酒中所含有效成分具有低毒性、低耐药性的优点，因此女士酒、碱性酒在抑制幽门螺旋杆菌方面具有广大的研究及应用前景。

此外，通过网络药理学进一步探究了碱性酒、女士酒抑制幽门螺杆菌的作用机制。查阅白酒相关文献收集白酒中含有的微量健康成分，主要包含萜烯类化合物：-石竹烯、香叶基丙酮等；芳香族类化合物：香兰素、4-甲基愈创木酚、阿魏酸等；吡嗪类化合物：四甲基吡嗪等诸多化学成分。根据PPI 网络分析，筛选得到度值排名靠前的潜在靶点，最终得到CUL4B、ACTB、PARP1、U2AF2 等53 个核心靶点，CUL4B是一类与胃部疾病关联密切的骨架蛋白，在胃癌、食管癌中均存在高度表达，通过调控Wnt/-catenin 信号通路影响细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化过程。PARP1、U2AF2 及ACTB 影响机体炎症因子的表达，且ACTB 在炎症性肠病中的表达与炎症、血管新生程度正向相关。所得到的核心蛋白总体上与机体炎症、细胞增殖、血管、癌症及凋亡等有关，以往研究显示，Hp 定植于胃部后，常先引起局部炎症，继而产生病变扩散，最终恶化至胃癌等各种恶性疾病。因此，白酒中的健康成分极有可能通过影响这些蛋白靶点从而抑制Hp 的定植生存，发挥抑制作用。

GO 分析中主要涉及对细菌来源分子的反应、对细菌的反应、凋亡信号通路的负调控以及防御反应的调节等BP 过程，溶酶体、膜筏、细胞外基质等CC 过程，氧化还原酶活性、血红素结合、裂解酶活性等MF 过程，进一步表明了这些微量成分与抑菌、抗炎等生物过程有着紧密联系。KEGG 通路富集分析结果显示，抑制Hp 主要通过调控IL-17 信号通路、TNF 信号通路、致病性大肠杆菌感染、MAPK 信号通路及PI3K-Akt 信号通路等发挥作用。IL-17、TNF 是常见的炎症因子，其在胃癌组织中过度表达并能促进胃癌细胞的增殖、迁移，加重炎症在体内的扩张，如今临床中常将IL-17、TNF 体内水平作为评价Hp 感染程度及所导致的慢性胃炎炎症程度的评价指标。MAPK 信号通路对炎症、应激、凋亡、细胞生长和分化等诸多重要生理过程发挥调节作用，罗强等实验证实，酒中含有的吡嗪类物质发挥作用于MAPK 通路从而降低HpM 诱导的炎症因子分泌，进而抑制由Hp 代谢物诱导的炎症。综上所述，白酒中微量健康因子主要通过调控多条通路作用于多个靶点，控制炎症因子的产生及传递，最终达到抑制幽门螺杆菌的作用，可为日后研究提供参考。