牛乳中庆大霉素的残留及检测

张 波，马 娅，张欣钰

（1.兰州石化职业技术学院，甘肃兰州 730070；2.甘肃省中医药大学 定西校区，甘肃定西 743000）

1 牛乳中庆大霉素的残留

抗生素在预防及治疗奶牛疾病中发挥着重要的作用，当人体长期食用含有抗生素的牛奶会应危害人体建康，因此，1979年世界卫生组织（WHO）明确提出牛奶中不应检出抗生素。牛奶中应检测的抗生素种类如表1所示。

表1 牛奶中应检测的抗生素种类

庆大霉素（Gentamicin）属于氨基糖苷类抗生素，是静止期杀菌药，抗菌活性强且高，因价廉易得而广泛应用于禽畜疾病的预防和治疗。庆大霉素抗菌活性作用机理：依靠离子吸附在菌体表面，造成膜的损伤，与细菌核糖体30S小亚基不可逆结合，抑制mRNA的转录和病原菌蛋白质的合成，从而消灭病菌，可以治疗需氧革兰氏阴性细菌所致的感染，但其有比较严重的耳毒性和肾毒性。奶牛在养殖过程中使用过量的庆大霉素会在体内残留、积聚，影响所获乳品的质量，人们长期食用会诱导产生耐药性，严重甚至会引发毒性作用。耳毒性的主要表现是：眩晕、平衡失调、听力减退、耳鸣甚至耳聋。肾毒性症状可为蛋白尿、肾功能减退严重时可出现肾衰竭和尿毒症[1]。为了保证人体的安全，中国农业农村部在《动物性食品中兽药最高残留限量》中，规定了牛奶中庆大霉素的最高残留标准为 200μg/kg。

2 庆大霉素残留的检测方法

2.1 理化分析法

理化分析方法基于庆大霉素的理化性质来分离和检测，检测部分多采用紫外分析、荧光分析、质谱等方法，而分离部分多采用色谱分离技术和电泳分离技术。理化分析方法因其检测灵敏度高、分离效果好，所获得的结果稳定，重复性高、准确可靠而得到了广泛应用。庆大霉素因为具有良好的水溶性，大的分子量及极性等特征，适合使用液相色谱进行分析，而采用气相色谱进行分析的报道极为少见。

Kowalczuk D 等建立了一种庆大霉素简单灵敏的检测方法，该方法基于邻苯二醛（OPA）与N-乙酰半胱氨酸（NAC）在碱性培养基中的结合反应。用NAC代替液体硫醇形成异吲哚衍生物，避免了形成的硫醇化合物令人不快的气味。该测定方法所获得的标准曲线的线性范围为 0.4～12.8μg/mL（r=0.9997），该方法的精密度在1.5～8.5。平均回收率可达100.02%[2]。

Kabra 等建立了一种简便、准确、特异的液相色谱法测定50μL血清中庆大霉素的方法。庆大霉素在70℃反应30min，转化为其三硝基苯衍生物。用氯仿从粗混合物中提取衍生物，用流动相冲洗反相辛基柱将庆大霉素分离为三种主要异构体。洗脱后的化合物在340nm处检测，并根据峰高或峰面积进行定量，色谱分析在11min内完成。庆大霉素的检出下限小于0.5mg/L，分析回收率为96.6%～99.3%，线性范围为15.0mg/L，精密度为2.2%～2.9%[3]。

高效液相色谱法（HPLC）又称“高压液相色谱”，指利用高压输送系统，通过液体流动相将样品泵入色谱柱，不同抗生素在柱内高效分离，进入检测器进行检测，完成分析。高燕霞等[4]用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法，以三氟乙酸-甲醇为流动相使硫酸庆大霉素在Apollo C18柱中得到了有效分离。依据ELSD原理，样品浓度与检测器对数响应呈线性关系，以此来测定硫酸小诺霉素、硫酸西索米星的浓度，该方法准确性好，灵敏度高。

色谱-质谱联用法是牛乳中抗生素分离和检测的一种重要的分析方法。色谱法最大的优势在于分离效率高，为混合物的检测提供了有力的保证。质谱法能帮助分析人员进行杂质分析，样品分析用量少，分析时间短，结果可靠准确。但是样品预处理复杂，为了能够最大限度地发挥每种分析方法的优势，常将两种方法联用，联用技术有：薄层液相色谱-质谱（TLCMS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、毛细管区域电泳-质谱联用（GIE-MS）等。刘雪红等报道了一种采用超高效液相色谱-串联质谱分析方法，准确、简单、快速地检测了牛奶中的7种氨基糖苷类抗生素（链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大观霉素）。分析过程采用乙酸铵缓冲溶液提取样品，分离色谱柱为CORTECS HILIC，流动相采用甲酸铵溶液洗脱。采用该方法所获的标准曲线范围为0.1～5μg/m L（r＞0.996），平均回收率可达80%～117.5%，检测限为10μg/kg，相对标准偏差均小于15%[5]。

2.2 微生物法

微生物检测法是牛乳中抗生素检测的一种传统方法，能够比较直观地反映抗生素的抗菌活性，使用的检测仪器简单，检测价格低廉，检测速度快，检测灵敏度高，广泛应用于食品、医药等行业。微生物检测的原理是：抗生素会对微生物的代谢产生抑制作用，以此来定性、定量确定牛乳中放热抗生素。如氯化三苯基四氮唑试验法（TTC法）、纸片法（PD法）和试剂盒法等。

TTC法的检测原理是在牛乳中生长的嗜热链球菌会将无色TTC溶液还原为红色的三苯甲臜，而牛乳中有抗生素存在会抑制嗜热链球菌的生长，TTC不会被还原溶液呈无色。TTC法应用广泛价格便宜。黄怡君等[6]使用TTC法对牛乳中的抗生素（青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素等9种）进行了检测，检测的灵敏性均达到了农业农村部对抗生素残留最高限量的要求。

王志强等报道了一种牛奶中多种抗生素残留的快速检验方法。该方法基于抗生素对细菌的抑制作用，快速检测牛奶中10种残留抗生素。该方法氨苄青霉素、青霉素最低检出限为0.001μg/mL，金霉素、土霉素、红霉素、四环素最低检出限为0.01μg/mL，链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素最低检出限为0.1μg/mL，该方法最低检出限结果优于GB/T 4789.27—2003TTC法。采用本方法成本低、灵敏度高、稳定性好，检测时间短，能同时测定10种抗生素[7]。

纸片法，目前主要使用的是：枯草杆菌法、嗜热脂肪杆菌法。枯草杆菌法只能检测β内酰胺类抗生素，而嗜热链球菌法可以检测除了β内酰胺类抗生素的多种抗生素。检测原理为浸有牛奶的滤纸片贴在含有枯草杆菌或嗜热脂肪杆菌的培养基中培养。若牛奶中含有抗生素会抑制菌种的生长，纸片周围会出现抑菌圈。若牛奶中不含有抗生素，菌种正常地生长，纸片周围有不透明的菌层[8]。

Qin Wu等建立了一种微生物抑制法，用于牛奶中抗生素的快速筛选。该方法样品预处理简便，以嗜热地芽孢杆菌 ATCC12980 作为指示菌，该试剂盒对牛奶中34种常见抗生素残留的检出限均低于或接近欧盟和中国规定的最大残留限量，包括β-内酰胺类（13）、氨基糖苷类（6）、四环素类（4）、磺胺类（6）、大环内酯类（4）、林可酰胺类（1）。检测的假阳性率为1%，假阴性小于5%。该试剂盒在4℃条件下，保质期超过6个月。此外，试剂盒检测结果与采用超高效液相色谱-质谱串联法结果保持一致，该试剂盒可用于牛乳中的抗生素筛查。该试剂盒具有灵敏度、特异性高、重现性、稳定性、可靠性高、操作简单、成本低、通量大等优点，具有广阔的应用前景。[9]

2.3 免疫分析法

免疫测定法基于抗原、半抗原同抗体特异性结合，检测灵敏度高，特异性强，测定成本低，广泛引用于医药、环境监测等领域。免疫分析法和其他方法的联用也是牛乳中庆大霉素检测技术发展的重要方向之一。

Yeluri T 等描述了基于 cyclamn-Au NPs的敏感比色法检测新霉素和庆大霉素的进展。利用紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、透射电子显微镜、动态光散射和zeta电位等方法对cyclamn-Au NPs进行了表征。在新霉素和庆大霉素存在下cyclamn-Au NPs会聚集，导致颜色从紫色变为蓝色，530nm处的特征吸收峰被红移到一个更长的波长（660nm）。采用紫外-可见吸收法测定了新霉素和庆大霉素的检出限，分别为 1.87 × 10-8mol/L 和 2.35 × 10-8mol/L[10]。

R.M Van Es等为了开发一种简单、快速的基于现场方法将牛奶中的庆大霉素量化到监管范围中，已经评估了许多方法，包括免疫分析与流动注射分析和电化学检测相结合。抗庆大霉素抗体被吸附在硝酸纤维素和聚碳酸酯固相载体上，并放置在与流动池安装的电极接触或电极-电池组件的上游。在竞争性免疫测定之后，根据电化学测量的葡萄糖氧化酶标记活性的程度对分析物水平进行量化。完全组装的流动池装置（原位方法）能够在10min内检测牛奶中 0到 100μg/kg的庆大霉素，变异系数值为 13.2%，并且没有样品预处理。在细胞组装和信号测量之前，流通池外需要孵育90min和高达 38.7% 的 CV 值。原位测定操作简单、可自动化，并且通过使用廉价、可大量生产的丝网印刷电极，适合开发一次性使用测量盒[11]。

王永智等[12]基于免疫分析法抗原和抗体的高特异性，结合表面等离子共振（SPR）技术将庆大霉素-BSA-GM偶联到S系列CM5芯片上，利用竞争抑制性准确高效地检测了牛乳中的庆大霉素。该方法检测准确度高，平均回收率为102.60%，RSD为9.58。采用该检测方法结果的重复性好，牛乳中庆大霉素浓度为3.2、12.8、51.2ng/mL时，计算所得的 RSD 结果分别为4.56%、4.83%、3.84%。本实验测得的中间精密度高，选择实验员A和B独立操作，检测六次，计算所得RSD为4.65%。庆大霉素在 0.8～102.4ng/mL的浓度范围内，仪器响应单位（Ru）和庆大霉素的浓度（ng/mL）有良好的线性回归关系（R2=0.997 7）。

3 结束语

牛乳中抗生素残留的常用的三种检测方法：理化分析法、微生物法及免疫分析法。理化检测法检测速度快、灵敏性高、特异性好、重复性强，但是仪器价格昂贵、样品的前处理过程复杂、程序复杂，常用于技术部门。微生物法操作简单、价格低廉但是微生物的培养时间较长，与检测人员的操作水平关系密切，在企业中使用较为广泛。免疫分析法灵敏度高，特异性强，样品处理量大，检测时间短，但是方法建立难度大，使用范围逐渐扩大。